CRISPR筛选推动遗传干扰研究的新发展

为了解决这一问题，研究人员开发了一种带有R1226A突变的氨基酸球菌Cas12a（AsCas12a）变体。该突变增强了体外实验中核糖核蛋白-DNA复合物作为切口DNA中间体的稳定性。研究结果发表在《Nature Biotechnology》期刊上，题为Engineered CRISPR-Cas12a for Higher-Order Combinatorial Chromatin Perturbations。这一组合CRISPRi平台能够高效发现增强子元件，并探索顺式调控元件的高阶组合干扰，为有效导航染色质干扰的巨大组合空间奠定了框架。

一、通过慢病毒递送的dAsCas12a融合蛋白进行的CRISPRi缺乏活性

研究还发现，提高denAsCas12a-KRAB的感染复数（MOI）可以改善CRISPRi的基因敲低效率。然而，在较低的MOI水平下，其活性下降甚至消失。为了解决这些不一致和缺陷，研究人员还探索了消除AsCas12a DNase活性的替代方法，例如使用截短的crRNA间隔区。然而，这些方法在不同细胞系中表现出较弱且不一致的CRISPRi活性。

图1 dAsCas12a-KRAB变体在慢病毒递送的crRNA中表现出弱且受剂量限制的CRISPRi活性

二、MultiAsCas12a-KRAB（R1226A/E174R/S542R/K548R）显著改善了通过慢病毒递送的CRISPRi

研究人员通过体外研究验证了在dAsCas12a中激活DNA切割功能是否会通过降低DNA亲和力来影响CRISPRi活性。研究发现，非靶链预切割后，dCas12a-DNA复合物的稳定性提高了20倍。R1226A突变以其显著降低切割活性而著称。通过引入这一突变，研究人员发现该变体比D908A失活变体更有效地结合DNA。研究结果表明，R1226A突变有助于延长染色质占据时间，并通过KRAB结构域增强转录抑制复合物的招募。在实验中，multiAsCas12a与denAsCas12a-KRAB进行对比时，显示出稳定且强大的CRISPRi活性，对低蛋白质和crRNA水平的敏感性较低，且几乎没有脱靶效应。这一改进不仅恢复了多个先前无效的crRNA构建体的效力，还保持了靶位点上的低插入缺失（indel）频率，表明其在有效基因敲低的同时，尽量减少了对基因表达的潜在干扰。

图2 MultiAsCas12a-KRAB（R1226A/E174R/S542R/K548R）通过促进切口DNA中间体，显著增强慢病毒递送的CRISPRi活性

三、MultiAsCas12a-KRAB通过高阶crRNA阵列慢病毒构建体实现多基因转录抑制

研究人员通过慢病毒crRNA阵列测试了multiAsCas12a-KRAB在CRISPRi中的活性，旨在评估其在每个细胞中靶向三个或更多基因位点的能力。实验结果显示，multiAsCas12a-KRAB在多种构建体中展现出了显著的CRISPRi活性，且基因敲低效果显著依赖于KRAB结构域。通过插入缺失（indel）分析，研究人员发现基因敲低主要是由于转录的非遗传扰动，而不是DNA的残余切割。在单细胞水平上，multiAsCas12a-KRAB相较于denAsCas12a-KRAB展现出更好的效果，成功实现了多个靶点的敲低，特别是在高阶构建体中，尽管有些构建体的活性有所下降。这些发现揭示了multiAsCas12a-KRAB在多重CRISPRi应用中的潜力，并强调了pre-crRNA序列背景对CRISPRi效率的不可预测影响。

图3 MultiAsCas12a-KRAB通过高阶crRNA慢病毒构建体实现多基因CRISPRi扰动

四、MultiAsCas12a-KRAB在组合单导向CRISPRi筛选中优于denAsCas12a-KRAB，并表现出与dCas9-KRAB类似的性能

研究人员开发了一个包含77,387个单一crRNA慢病毒构建体的文库，用以评估Cas12a CRISPRi活性与转录起始位点（TSS）的关系及其对细胞适应性的影响。在K562细胞中表达multiAsCas12a-KRAB的组合适应性筛选结果显示，与denAsCas12a-KRAB相比，multiAsCas12a-KRAB具有更高的细胞适应性评分，指示其性能更优且非特异性基因毒性更低。结果揭示了multiAsCas12a-KRAB在TSS周围有效地生成了CRISPRi活性的元基因谱，与dCas9-KRAB相似，且优于denAsCas12a-KRAB。尽管有些靶向非典型PAM的crRNAs表现出活性，但PAM序列内各个crRNA的活性差异显著，这些差异不能被CRISPick模型完全预测。

图4 MultiAsCas12a-KRAB支持针对TSS的组合CRISPRi筛选，包含6重crRNA阵列

五、MultiAsCas12a-KRAB通过6重crRNA阵列实现组合CRISPRi筛选

研究人员构建了一个新的文库，以评估multiAsCas12a-KRAB在组合CRISPRi筛选中的性能，并在表达该变体的K562细胞中进行了筛选。实验结果表明，multiAsCas12a-KRAB具有高度的重复一致性，并且没有引起显著的非特异性基因毒性。此外，测试位点间隔区的细胞适应性缺陷相较于单个crRNA较弱，活性单crRNA的召回率介于59%至90%，这表明大多数单个活性crRNA在整合到6重阵列中后仍能保持其活性。

图5 MultiAsCas12a-KRAB CRISPRi支持增强子扰动与发现

六、顺式调控元件的发现与高阶组合干扰

尽管人类基因组估计有大约50万个增强子，但只有少数经过了功能测试。这项研究验证了multiAsCas12a-KRAB通过CRISPRi干扰基因启动子及其增强子的能力，特别是其靶向HBG1/HBG2旁系基因和HS2增强子的效果。在K562细胞的CD55基因座中，研究人员鉴定了多个之前未被表征的增强子，这些增强子调控CD55的表达，标志着在髓系细胞中首次功能验证的增强子。同时，他们还利用multiAsCas12a-KRAB研究了MYC基因座上高阶扰动的影响，发现联合靶向多个顺式调控元件比单独靶向启动子有更强的基因敲低效果。这些结果强调了multiAsCas12a-KRAB在增强子研究中的实用性，并表明组合靶向调控元件可以更有效地调控基因表达，为高效测试遗传扰动建立了新的框架。

图6 multiAsCas12a-KRAB对顺式调控元件的高阶组合靶向建立了群体测试框架

总体而言，CRISPR-Cas介导的染色质干扰研究正在迅速发展。通过灵活地结合多种效应蛋白结构域，multiAsCas12a为针对多个染色质干扰目标的群体测试提供了可能。利用这种群体测试框架，multiAsCas12a能够在前所未有的规模上推动组合遗传过程的设计和理解，涵盖广泛的生物学领域。这项研究确立了multiAsCas12a-KRAB作为一个强大的高阶组合CRISPRi干扰平台的地位，展示了其在调控基因转录和增强子功能方面的优势，使其成为精确基因调控的有力工具。