使用病毒系统或mRNA电穿孔构建TCR原代T细胞

近日圣路易斯华盛顿大学发表的"Engineered T cell therapy for central nervous system injury"论文中使用单细胞RNA测序技术证明了小鼠和人脊髓损伤相关T细胞的克隆扩增，并识别出CD4+ T细胞克隆对抗原的特异性；采用基于mRNA的TCR重构策略，以最小化长期激活自体反应性T细胞带来的潜在不良影响；在CNS损伤模型中评估了这些工程化T细胞的神经保护效果。在动物模型中展示了良好的神经保护效果，特别是在调节免疫微环境方面表现突出。+

我们这里以构建TCR-原代T细胞为例，关注并介绍使用病毒系统或mRNA电穿孔系统将TCR重构在原代T细胞中的应用，以下方法是使用小鼠原代T细胞，人原代TCR-T细胞的构建同理。

逆转录病毒制备

质粒载体：pMIG II。

TCRα和TCRβ链的序列通过自切割肽P2A连接用于表达单个链。TCRα-P2A-TCRβ被插入到载体pMIG II中，用于原代T细胞中的TCR重构。

Phoenix-ECO细胞在转染前4-8h接种于六孔板中。使用TransIT-293转染试剂将含有目标TCR基因的逆转录病毒质粒转染到Phoenix-ECO细胞中，按照制造商的说明进行操作。转染后8-12h，去除培养基并更换为含15%（体积比）胎牛血清的IMDM。转染48h后收集含有逆转录病毒颗粒的上清液，用0.45μm的注射滤器过滤后即可用于感染。

生成TCR-原代T细胞

十二孔板用稀释在PBS中的抗CD3和抗CD28抗体（Ab_CD3浓度为1.5 μg/ml；Ab_CD28浓度为0.5 μg/ml）在4°C下过夜包被。从C57BL/6J小鼠中收获脾脏和淋巴结，并使用EasySep小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒分离出原代CD4+ T细胞。分离出的CD4+ T细胞在含有1 μg/ml Ab_CD28的培养基中重悬，接种于十二孔板，并在37°C下孵育。24h后，加入1 ml含逆转录病毒颗粒的培养基，并添加转染试剂polybrene，终浓度为8 μg/ml。细胞和病毒混合物在32°C下以2000g离心1h，然后在37°C下孵育6-8h。经过两轮感染后，细胞洗涤并重悬于新鲜培养基中，含有2 ng/ml重组小鼠IL-2，转移到新的十二孔板。细胞在37°C下培养至少12h，洗涤并重悬于PBS中，通过70μm细胞滤网过滤，准备注射到小鼠体内。每只小鼠在受伤后静脉注射1-2百万个功能性的TCR表达细胞（2-5百万个总细胞）。通过流式细胞术量化GFP阳性细胞来评估感染效率。

图1 TCR在原代CD4+ T细胞中通过逆转病毒感染进行重构的示意图。

基于mRNA的瞬时TCR表达

质粒载体：pCMV-T7。

TCRα和TCRβ链的序列通过P2A自切割肽序列连接，并插入到pCMV-T7载体中作为mRNA合成的模板。使用HiScribe T7 ARCA mRNA Kit按照制造商的说明合成mRNA。简言之，将pCMV-T7-TCR质粒与T7 RNA聚合酶混合并在37°C下孵育45min进行RNA合成。加入DNase I并在37°C下孵育15min以消化DNA模板。消化后，通过在37°C下孵育40min使用poly(A)聚合酶添加poly(A)尾巴。使用Monarch RNA Cleanup Kit纯化合成的mRNA并用水洗脱。用NanoDrop 2000测定mRNA浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳分析mRNA，然后储存在−80°C。

原代CD4+ T细胞被分离并用Ab_CD3和CD28激活，如先前所述。经过24h的激活后，细胞被洗涤并重新悬浮在含有2 ng/ml重组小鼠IL-2的新鲜培养基中，转移到新的六孔板并在37℃下再培养12-24h，然后进行电穿孔。使用4D-Nucleofector和Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit按照程序DN-100对T细胞进行电穿孔。T细胞用PBS洗涤并重新悬浮在Nucleofector溶液中加入补充物。对于一次反应，1×10^7个T细胞在100 µl缓冲液中与10 µg mRNA一起重新悬浮。电穿孔后，T细胞在无血清培养基中于37℃培养30min，然后转移到含有2 ng/ml重组小鼠IL-2的培养基中。细胞至少培养3h，洗涤，重新悬浮在PBS中，并通过70µm细胞滤网过滤，以准备注射到小鼠体内。每只小鼠在受伤后静脉注射1-3百万个总细胞。

图2 通过mRNA电穿孔在原代CD4+ T细胞中瞬时重构TCR的示意图。

基于CRISPR-Cas9的内源性TCR敲除

质粒载体：pSpCas9nucl-mCherry-gRNA。

以下的向导RNA（gRNA）序列用于靶向内源性TCRs：ATTGATTTGGGAGTCAAAGT（gTCRα）和CTGACCA CGTGGAGCTGAGC（gTCRβ）。含原始gRNAs的DNA片段在pSpCas9nucl-mCherry-gRNA质粒中被替换为靶向TCRs的gRNAs。pSpCas9nucl-mCherry-gTCRs质粒通过电穿孔转入原代T细胞，并在电穿孔后2天通过流式细胞术检测TCR表达。然后，含功能性gRNAs靶向TCRs的DNA片段插入到pMIG II载体中，并转导到从Rosa26-Cas9小鼠中分离的T细胞。在感染后3天通过流式细胞术检测TCR表达。具有同义突变的CRISPR-Cas9抗性TCR基因克隆到pCMV-T7载体中用于体外RNA合成。

图3 流式细胞仪分析用于检测在递送靶向内源性TCR的gRNA三天后，从Cas9转基因小鼠中分离的T细胞内源性TCR的去除情况

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