PKM1、PBRM1和S100A9基因敲除细胞为癌症治疗提供

基因敲除细胞是指利用CRISPR技术进行基因编辑，通过设计特定的sgRNA靶向目标基因的剪切位点，使Cas9蛋白与sgRNA结合并将目的基因从细胞中"剪切"掉，从而实现基因敲除。基因敲除细胞在生命科学、医学和药物研发等领域都有着广泛的应用前景，如利用基因敲除技术建立疾病模型、进行药物筛选和靶点验证、敲除致病基因实现对疾病的基因治疗等。本文选取三篇基因敲除细胞的相关研究为大家进行解读，带您了解这一前沿技术的最新进展。

一、CRISPR/Cas9系统成功敲除PKM1基因，优化CHO细胞系的乳酸生成行为

中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO）是生物制药行业最常用的哺乳动物细胞系之一，用于生产各种治疗性蛋白质，如抗体、激素和其他重组蛋白。丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase Muscle，PKM）是一种负责在糖酵解过程中将PEP转变为丙酮酸的酶，丙酮酸可用于细胞能量产生或转化成乳酸。在CHO细胞中，PKM1的表达水平与乳酸生成行为直接相关。研究人员通过CRISPR/Cas9的技术手段敲除PKM1基因可以消除乳酸积累。

研究人员在本研究中采用CRISPR/Cas9技术敲除了PKM1基因，目的是探索PKM1在CHO细胞系乳酸生成中的功能，并探究PKM1水平与乳酸生成之间的直接关系。研究结果显示，在PKM1基因被敲除的细胞系中，未观察到乳酸积累，即使在促进乳酸积累的培养条件下，乳酸积累也得到了有效控制，这表明PKM1的活性对于乳酸的生成至关重要。此外，通过CRISPR/Cas9系统敲除PKM1基因的细胞系在生产力和细胞活力方面与野生型细胞系相似，说明PKM1的缺失并不会对细胞的生存能力或生产能力产生不利影响。在工业生产中，高水平的乳酸生成可能会导致CHO细胞活力和生产力的下降，影响生产效率和产品质量。乳酸积累还可能引起培养基pH值下降，需要添加碱性物质调节pH值，这可能会导致渗透压增加，进一步影响细胞生长和蛋白质生产。利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术敲除或抑制PKM1的表达，有助于减少或消除乳酸生成，提高生产效率和产品质量。

图1 消除或减少PKM 1表达可避免mAb-2细胞系中的乳酸生成行为

二、PBRM1基因敲除与ccRCC中较低的免疫原性TME相关

肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是全球十大常见恶性肿瘤之一，最常见的组织学亚型为透明细胞肾细胞癌（clear cell RCC，ccRCC）。ccRCC中存在重要的继发性基因突变，包括PBRM1（polybromo-1）基因。PBRM1是开关/蔗糖非发酵(SWI/SNF)染色质重塑复合体的一部分，约40%的ccRCC存在PBRM1突变。到目前为止，关于PBRM1缺失对免疫反应的影响的数据是不一致的，因此研究人员对于ccRCC中PBRM1缺失对肿瘤微环境（TME）的影响进行了研究。

通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究人员敲除了Pbrm1基因，并建立了Pbrm1敲除的Renca小鼠RCC细胞系及其肿瘤模型，同时使用了Renca-Balb/c免疫小鼠模型进行实验。他们利用免疫组织化学（IHC）染色技术对小鼠肿瘤中的免疫标记物进行了评估，包括CD3、CD8、CD4、PD-1和P-STAT1。结果显示，与Pbrm1基因敲除小鼠相比，对照组小鼠肿瘤中CD3、CD4、CD8 T细胞和p-STAT1阳性细胞的水平显著更高，而且免疫检查点蛋白PD-1在对照肿瘤中的表达也更强烈。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除了Pbrm1基因的细胞系构建肿瘤模型证明Pbrm1缺陷与较低的免疫原性肿瘤微环境有关，对肿瘤的免疫治疗具有重要意义。

图2 Pbrm1敲除肿瘤与低免疫原性TME相关

三、S100A9的敲除为SICM的致病机制的研究提供更进一步探索

败血症性心肌病（Sepsis-induced cardiomyopathy，SICM）是一种常见的由败血症引起的心功能障碍，SICM的病理机制非常复杂，包括几个关键因素，如心肌抑制、线粒体功能障碍、炎症反应和氧化应激。S100钙结合蛋白A9（S100A9）是一种钙和锌结合蛋白，在炎症和免疫反应中发挥着关键的调节作用，但目前对S100A9诱导败血性心力衰竭和心肌损伤的确切机制了解有限。

研究人员通过CRISPR-Cas9技术敲除了小鼠S100a9基因，并让原代心肌细胞接触脂多糖，以此模拟SICM。他们通过测量炎症标志物和S100A8/9的表达来成功模拟败血症诱导的心肌病。胸部超声心动图的结果显示，与野生型小鼠相比，S100a9基因敲除小鼠在败血症诱导的心肌病中心肌损伤有所减轻，且心肌功能得到恢复。使用透射电子显微镜对线粒体嵴密度的测量发现，在野生型对照组中心肌细胞的线粒体形态均匀，而在野生型败血症组中，线粒体的数量和大小异质性显著增加。敲除S100a9基因后，线粒体的损伤有所减轻，并恢复了正常的结构。这些研究结果表明S100A9与败血症诱导的心脏损伤和功能障碍有关，并揭示了S100A9诱导的氧化应激和线粒体功能障碍的潜在机制。利用CRISPR-Cas9技术敲除S100A9基因的细胞来研究该基因与SCIM间的关联性，提供一种SCIM可能的治疗方案，对SCIM致病机理的研究做出贡献。

图3 敲除S100a9基因减轻了线粒体损伤和氧化应激