个性化mRNA疫苗联合PD-1抑制剂治疗ESCC患者

治疗性肿瘤疫苗是教育免疫系统精确对抗肿瘤的宝贵工具。癌细胞具有遗传不稳定性和丰富的体细胞突变，导致产生肿瘤特异性抗原（TSA），称为新抗原。基于新抗原的癌症疫苗的主要目标是激活免疫系统并引发有效的肿瘤特异性T细胞反应。目前尚未有关于晚期食管鳞状细胞癌（ESCC）患者在接受个性化mRNA疫苗治疗后达到部分缓解的报道。随着个性化新抗原免疫疗法的出现，这里海军军医大学上海长海医院，报告了一例67岁男性患者，诊断为ESCC并伴有多个增大的纵隔淋巴结，首次使用了mRNA疫苗。对食管复发灶的组织样本进行了全转录组测序。通过生物信息学分析鉴定了新抗原。选择了top20的新抗原组成多新抗原疫苗，以每次1mg每3周一次的剂量连续注射4个周期，并联合PD-1抑制剂。在第4个周期后的8周，患者接受了单次PD-1抑制剂加强剂量。此外，在4个周期的疫苗治疗前后评估了免疫反应，并通过影像学检查评估了病灶。结果表明，基于新抗原的疫苗显著激活了肿瘤特异性免疫反应。TCR V-J配对分析显示寡克隆TCRs的丰度增加，表明同质性提高。治疗后，患者的血液肿瘤突变负荷（bTMB）从7.63降至1.53 Mut per Mb，表明肿瘤细胞生长受到抑制。这些发现表明，肿瘤疫苗与PD-1抑制剂的联合使用激活了免疫反应，增强了抗原识别和反应能力。除了PD-1抑制剂治疗引起的4级血小板减少症外，未观察到3级或更高级别的药物相关不良事件。患者达到了部分缓解（PR），无进展生存期（PFS）为457天，总生存期（OS）为457天，缓解持续时间（DOR）为377天。该报告表明，将个性化mRNA疫苗疗法与PD-1阻断疗法相结合可能是治疗晚期食管癌患者的有效策略。然而，仍需进一步的临床试验来确认个性化新抗原免疫疗法在治疗晚期ESCC中的有效性和安全性。

鉴定新抗原并制备疫苗

食管癌组织通过胃镜检查获得，然后保存用于WES和RNA-seq。测序质量控制使用Trimmomatic来修剪平均Phred得分低于20的reads并移除标准接头。使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA）将reads比对到人类基因组（hg38）。使用Picard工具SortSam对生成的BAM格式映射文件进行排序，并使用Picard工具MarkDuplicates标记和移除重复reads。使用GATK进行碱基重新校准以减少假阳性变异位点。使用GATK Mutect2调用体细胞突变。所有等位基因频率<0.05或覆盖度<10×的体细胞突变被排除以消除假阳性位点。使用OptiType从WES数据中推断每个样本中的HLA I类等位基因（HLA-A、HLA-B和HLA-C），而HLA-II类等位基因（HLA-DPB1）则通过HLA-LA检测。使用Kallisto根据RNA-seq数据量化基因/异构体在转录本每百万（TPM）中的丰度。参考转录组从Ensembl数据库（GRCh38）下载。

所有突变都通过Ensembl变异效应预测器（VEP）进行注释，以识别非同义突变。对于每个错义突变，使用NetMHCpan-4.1预测包含突变氨基酸的8-11肽与患者HLA I类等位基因的结合亲和力，而对应的15肽与HLA II类等位基因的结合亲和力则使用NetMHCpanII-4.0进行预测。为了识别新抗原候选物，评估了突变肽的各种特征，包括突变的等位基因频率、HLA等位基因与突变肽之间的结合亲和力、HLA等位基因与MHC分子之间的亲和力以及相应的野生型肽，以及突变肽的表达谱。保留了产生具有相应基因表达水平>1 TPM且IC50<500nM的突变肽的突变，用于进一步分析。剩余的新抗原候选物进一步使用pTuneos进行排名，并选择了前20个新抗原序列用于下游mRNA疫苗的设计和制造。

疫苗接种

患者接受了这种个性化疫苗与PD-1抑制剂联合注射，每3周重复一次，总共4个周期。在第4个周期后的8周，患者接受了单剂量的PD-1抑制剂加强注射。治疗过程如图1B所示。在每个治疗周期中，在2天内将总共1mg疫苗（每注射部位0.2mg）皮下注射到左上肢、右上肢、左下肢、右下肢和腹部。此外，PD-1抑制剂toripalimab单抗在mRNA疫苗接种前一天注射240mg。另外，在治疗前后分离了患者的外周血淋巴细胞，并通过高通量测序分析了TCR的CDR3多态性。此外，获得了ctDNA（循环肿瘤DNA），并通过605个基因的高通量测序确定了bTMB。

病例报告和治疗过程

2011年1月7日，一名63岁的男性患者在上海长海医院胸外科接受了根治性食管切除术。术后病理报告提示中段食管鳞状细胞癌，病理分期为T2N1M0。2020年7月，该患者在胃镜和纵隔增强CT检查后被诊断为食管癌复发并伴有纵隔淋巴结转移。2020年9月参加了mRNA疫苗（NCT03468244）的临床试验。

为了生成mRNA疫苗，设计的序列被合成并亚克隆到mRNA表达载体中，然后转录成单链mRNA，并用纳米脂质体（Lipopolyplex，LPP）包覆，该纳米脂质体由斯微生物制备并提供（图1A）。本病例的治疗过程如图1B所示。在前4次疫苗治疗过程中，患者在第二天出现了1级发热，但没有寒战或头痛。最常见的治疗出现的不良事件（TEAEs）（1级）是注射部位发红、肿胀、疼痛性发热和肌肉硬结，所有这些症状都在每次注射后的第3天消退。在第4次周期后的第8周给予了一剂toripalimab单抗。随后几天血小板计数持续下降。在PD-1抑制剂给药后7天，发生了4级不良事件血小板减少症。根据处理与PD-1抑制剂治疗相关的不良反应的原则，开始每日静脉注射甲泼尼龙2mg/千克体重和血小板生成素（TPO）15000 U。连续3天给予人免疫球蛋白（pH 4，20g）静脉注射。3天后血小板计数恢复到5×10^9/L，5天后恢复到105×10^9/L。随后停止了TPO。糖皮质激素每日口服一周，然后逐渐减量并在6周后停药。没有其他与疫苗治疗相关的3级或更高级别的药物相关不良事件。之后，患者未再接受进一步的疫苗或PD-1抑制剂治疗。然而，在首次疫苗治疗后的457天，患者因肺部感染去世。排除了肺部感染与疫苗和PD-1抑制剂治疗之间的关联。

图1 疫苗设计步骤和患者时间线。A. mRNA疫苗结构示意图。B. 事件的时间线和所施治疗的总结。

病灶在第2周期和第4周期后通过影像学进行评估，并在第154天、第247天和第457天根据实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1指南进行评估。确定了纵隔淋巴结中的两个靶病灶。与接种疫苗前相比，第4周期后病灶短径之和减少了36.4%（从51mm减少到29mm），表明部分缓解（PR）（图2A-G）。值得注意的是，左侧淋巴结在第154天无法准确测量，在第247天和第457天无法清晰显示。不幸的是，患者在首次接种疫苗457天后因肺部感染去世。值得注意的是，尽管疫苗治疗已停止38周，肿瘤仍在继续缩小。该患者的PFS为457天，OS为457天，DOR为377天。

图2 接种前后病灶的详细情况。

通过高通量测序分析了TCR CDR3多态性。结果表明，TCR V和J基因的类型和频率没有显著变化（图3A-D）。然而，V-J配对分析显示，寡克隆TCRs的丰度增加（图3E-H），表明TCRs的同质性提高。这一发现也通过克隆多样性的分析得到证实，均匀度从第1天的0.6426增加到第84天的0.7751。此外，Shannon指数也显示，样本在第84天的TCR库的克隆多样性高于第1天（从5.9增加到7.0）。这表明疫苗治疗激活了免疫反应，导致更强的抗原识别和反应能力。此外，经过4个周期的治疗后，患者的bTMB从7.63降至1.53 mut/Mb，表明肿瘤细胞生长受到抑制（表1）。

图3 通过高通量测序分析TCR CDR3多态性。

表1 bTMB和ctDNA基因突变列表

总结

个性化疫苗治疗近年来一直是肿瘤免疫研究的主要热点之一。治疗性肿瘤疫苗包括肽-、DNA-、RNA-、蛋白质-和肿瘤细胞-疫苗，旨在产生针对肿瘤细胞的新肿瘤特异性T细胞反应。与检查点调节剂和其他可逆转免疫抑制的新药联合治疗正在迅速发展，尽管仍需更多研究来确定最佳组合和每个成分的最佳剂量安排。基于mRNA的方法已成为癌症免疫治疗的一个有希望的平台。调整给药途径和多种mRNA疫苗与其他免疫治疗药物（如检查点抑制剂）的联合递送进一步增强了宿主的抗肿瘤免疫力，并增加了消除肿瘤细胞的可能性。

食管癌中最常见的组织学类型是食管鳞状细胞癌。尽管多学科治疗手段有所发展，但其预后仍然不佳。最近，单克隆抗体抑制PD-1或PD-L1的开发已在多种恶性肿瘤患者中取得了显著的治疗反应，包括食管鳞状细胞癌。然而，由于耐药性的存在，只有少数患者能够获得临床益处，特别是那些具有微卫星不稳定低（MSI-L）状态和低肿瘤突变负荷（TMB）的患者。

目前，个性化疫苗治疗作为一种新的肿瘤治疗方法，值得更多的关注和深入探索。首先，由于癌症疫苗基于新抗原，因此快速准确地分析新抗原至关重要。仅凭WES数据无法反映基因的转录特征。与WES相比，结合mRNA表达测量的综合分析可能为新抗原分析提供更准确的方法，例如，结合分析基因突变、HLA亲和力、野生型基因谱、HLA亲和力、突变基因的转录以及突变基因的共享，如上所述。其次，由MHC II分子和CD4+ T细胞驱动的突变衍生表位的免疫识别也非常重要。在设计mRNA疫苗疗法时，应分析MHC I类和II类限制性新抗原。第三，目前用作肿瘤疫苗载体的纳米脂质体是最重要的疫苗递送平台之一。纳米脂质体将疫苗成分递送到APCs，特别是DCs。毫无疑问，高效准确地将疫苗递送到APC细胞的药物递送平台是疫苗治疗成功的重要要求之一。此外，肽疫苗与PD-1免疫检查点抑制剂联合使用在NSCLC、黑色素瘤和HPV16相关癌症患者中表现出令人鼓舞的疗效。与PD-1抑制剂联合使用历来是肿瘤疫苗临床试验中常用的方法。然而，必须密切关注PD-1抑制剂应用引起的不良反应。

这里研究不可避免地存在一些局限性，应予以注意。首先，该研究是一个单一病例报告，需要进一步的临床试验来证实个性化新抗原免疫疗法在治疗晚期ESCC中的有效性和安全性。其次，该患者患有伴有淋巴结转移但无远处器官转移的食管癌。患有淋巴结转移的患者，由于淋巴结富含免疫细胞，可能更有可能从免疫治疗中获益。尚不清楚伴有远处器官转移的ESCC患者是否能从RNA疫苗治疗中受益。临床研究需要纳入更多伴有器官转移的患者，以确定RNA疫苗治疗对这些患者的潜在益处。第三，由20个新抗原激活的抗原特异性TCR序列可以单独进行更详细的分析，以更准确地显示由测序新抗原激活的肿瘤特异性免疫反应。PD-1抑制剂的时机和剂量也可以进一步探讨，以防止未来与免疫治疗相关的中度到重度不良反应的发生。

总之，这里报告了首例采用多新抗原编码mRNA个性化疫苗治疗MSI-L和TMB-L晚期食管癌患者的病例，该患者达到了部分缓解。此病例表明，将个性化mRNA疫苗与PD-1抑制剂联合使用可能是治疗晚期食管癌的有效策略。与疫苗治疗联合使用的疗法仍有待进一步探索。

Wang B, et al. Personalized mRNA vaccine combined with PD-1 inhibitor therapy in a patient with advanced esophageal squamous cell carcinoma. Am J Cancer Res. 2024 Aug 25;14(8):3896-3904.

Zhang C, et al. Current advances in the application of nanomedicine in bladder cancer. Biomed Pharmacother. 2023;157:114062.

Miao L, et al. mRNA vaccine for cancer immunotherapy. Mol Cancer. 2021;20:41.

Xu J, et al. Comparison of efficacy and safety between neoadjuvant chemotherapy and neoadjuvant immune checkpoint inhibitors combined with chemotherapy for locally advanced esophageal squamous cell carcinoma: a systematic review and meta-analysis. Int J Surg. 2024;110:490-506.