通过个性化抗原不可知筛选方法鉴定TCR，并发现其靶向的抗原

目前，治疗性TCR的选择严重依赖于已知的目标抗原，这一条件将大多数患者排除在治疗之外。通过直接识别肿瘤特异性T细胞克隆型并使用其TCR进行TCR-T制造，可以推进针对侵袭性实体瘤患者的ACT治疗。这里，德国美茵茨大学、HS Diagnomics GmbH和TheryCell GmbH合作，提出了一种方法，通过比较TILs和邻近组织驻留淋巴细胞中的TCRβ链库来识别肿瘤特异性克隆型。在7名NSCLC患者中，根据TIL丰度和高肿瘤与非肿瘤频率比选择肿瘤特异性克隆型。在2名患者中，证明了预测的肿瘤特异性克隆型对自体肿瘤产生了反应。在第三名患者中，利用4个候选肿瘤特异性TCR构建了TCR-T细胞，这些细胞对患者的肿瘤和HLA匹配的NSCLC细胞系显示出反应性。然后使用这些TCR-T细胞筛选候选新抗原和异常表达的抗原。3个TCR识别了由HLA-A*01:01呈递的反复出现的驱动突变KRAS Q61H肽段ILDTAGHEEY。这些TCR也在肿瘤复发中占主导地位，其中1个在游离DNA中被发现。在独立的KRAS Q61H阳性癌症中发现同源TCR表明，对于具有表达KRAS Q61H突变肿瘤的HLA匹配患者，这是一个治疗机会。

与CARs相比，TCRs可以识别任何肿瘤细胞区室中的抗原，包括胞内表达的TAAs和TSAs。然而，TCR识别依赖于HLA分子呈递的肽段，这意味着治疗性TCR只能用于具有相应抗原的HLA匹配患者。因此，迄今为止大多数临床TCR-T研究都集中在由广泛存在的HLA-A*02:01呈递的常见TAAs的肽段上。Afami-cel（商品名为Tecelra）针对MAGE-A4/HLA-A*02:01的TCR-T细胞在肉瘤患者中应用的获批；以及Tebentafusp用于治疗葡萄膜黑色素瘤的一种识别gp100/HLA-A*02:01和CD3的TCR衍生双特异性受体的获批，都是显著的例子。针对其他常见TAAs共享表位的TCR-T临床试验观察到严重的on-target/off-tumor反应，因为即使在少数正常组织中低表达的TAAs也会导致严重的自身免疫副作用，包括因亲和力优化的TCRs对抗MAGE-A3而导致的致命事件。

除了毒性风险外，上述描述的TAA定向TCR-T疗法目前只能为少数患者提供治疗。这些障碍可以通过使用天然TCR靶向TSAs来克服，TSAs包括所有类型的经典蛋白质中的体细胞非同义突变以及异常转录和翻译的基因产物，统称为新抗原。虽然新抗原被证明是免疫检查点抑制（ICI）和TIL治疗效果的基础，但只有少量被发现具有免疫原性。此外，新抗原在肿瘤和转移灶中的表达通常是异质性的，大多数新表位在个体肿瘤中是独特的。治疗利用需要个性化，并且识别有效的TCR-新表位组合耗时且劳动密集。尽管如此，针对难治性实体瘤患者私人新表位的个性化TCR-T细胞疗法正在临床开发中。源自致癌基因反复突变的新表位被认为是最佳靶标，因为它们驱动肿瘤的发生和发展，并且在病变中表现出克隆性和稳定表达。尽管自然存在的针对反复出现的新抗原特异性T细胞在患者中仅偶尔有报道，但其主要治疗活性已在临床上得到证实。此外，基于TCR-mimic抗体识别常见致癌基因p-HLA复合物的人工免疫受体的发展显示了对这些新抗原靶向的巨大兴趣。个别癌症患者的TILs包含多种针对私人和共享肿瘤抗原的肿瘤特异性T细胞克隆型，包括克隆驱动突变。虽然它们可能代表了患者特异性最优的免疫优势T细胞反应组合，但在较大的非肿瘤特异性旁观者T细胞池中通常被稀释。至少部分肿瘤经历过的克隆型处于耗竭或功能失调状态，降低了它们对现有TIL扩增方案的响应性。

从TILs中直接识别肿瘤特异性T细胞克隆型，对最有潜力的TCRs进行测序和克隆以制造自体TCR-T细胞，为许多患者提供了一种治疗选择。当前的发展采用基于选择性细胞表面标志物或单细胞基因表达特征来分选候选的肿瘤特异性T细胞。然而，从制造和监管的角度来看，这些方法是否真正只选择了肿瘤特异性TCRs以及如何选择最有效的TCRs用于治疗尚不清楚。个性化的新抗原特异性TCR-T方法表明，每名患者制造包含2-3种不同TCRs的细胞产品是可行的。同样，对于一种抗原不可知的TCR选择方法，从多种（2-4种）免疫优势抗肿瘤克隆型中选择TCRs以应对抗原异质性和免疫逃逸机制是直接可行的。

在这项研究中，介绍了一种抗原不可知的筛选方法，通过比较肿瘤和邻近正常组织浸润T细胞克隆型的高通量TCR库分析，来识别肿瘤特异性的T细胞克隆型。在7例NSCLC患者中，鉴定了候选的肿瘤特异性TIL克隆型，在其中6例患者中，单细胞基因表达分析支持了这一选择。在3例患者的实验验证表明，由该方法预测的肿瘤特异性克隆型对自体肿瘤细胞有反应。对于其中一位患者，通过选择4种肿瘤特异性的TIL克隆型来模拟治疗性TCR-T细胞的生产，克隆其αβTCR序列，并在健康供体的T细胞中进行了合成和表达。利用TCR-T细胞进行筛选，以识别表达的非同义新表位和过表达的TAA候选物，结果显示4个TCR中有3个特异性识别了由HLA-A*01:01呈递的突变KRAS Q61H肽段ILDTAGHEEY。所选TCR的肿瘤特异性和治疗潜力通过TCR-T细胞的功能表征、原始TIL克隆型的基因表达特征、这些克隆型在术后超过30个月获得的肿瘤复发中被发现以及在29份存档（FFPE）肿瘤样本中检测到与之高度同源或相同的TCR（确认存在KRAS Q61H突变）得到了加强。结果突显了该方法直接选择肿瘤特异性TCR用于治疗的能力，并提示突变KRAS特异性TCR作为HLA-A*01:01阳性且KRAS Q61H阳性肿瘤患者的现成TCR-T疗法候选物。

NSCLC患者的临床数据和临床样本的获取

对于7名患者，病理学家从多余组织中选择了新鲜肿瘤和邻近的正常肺组织样本，并将其与外周血样本一起运送至实验室进行即时处理。研究患者在实验策略中的分配情况如图1A所示。所有患者均接受了以治愈为目的的肺叶切除术和淋巴结清扫术。对3名患者进行了功能分析：患者1（男/57岁）于2016年5月被诊断为左下叶肺鳞状细胞癌，患者2（女/73岁）于2020年9月被诊断为右上/中叶腺癌，患者3（女/54岁）于2018年6月被诊断为左上叶肺腺癌。对于患者3，除了手术中的原发肿瘤临床样本外，还分析了包括肿瘤复发、血液和血浆样本在内的随访样本。因此，提供了更多关于她的临床过程和所分析临床样本来源的详细信息：2019年7月通过PET-CT诊断出局部复发，患者接受了联合化疗和放疗，并随后接受了一年的durvalumab维持治疗。2021年1月，位于主动脉肺窗的局部复发病灶增大。进行了扩大肺切除术。从复发肿瘤中，病理学家保存了甲醛固定的石蜡包埋（FFPE）组织样本。进一步的血液样本在2021年9月和12月收集并处理。患者的临床过程总结在表1中，采样时间点见图S1。连续FFPE切片的免疫组化（IHC）显示患者3的原发和复发肿瘤均表达HLA-A，并且PD-L1比例评分>50%。原发和复发肿瘤中的CD3、CD4和CD8阳性TIL亚群主要分布在肿瘤周围区域而不是肿瘤核心。自2021年以来，患者一直保持持续临床缓解状态。

表1 患者3的临床病程

图1 研究患者的分配（A）及在患者1（B）、患者2（C）和患者3（D）中识别和选择肿瘤反应性T细胞克隆型。

图S1 患者3的临床数据，样本收集，分析及方法应用。

手术材料的准备和肿瘤特异性TILs的鉴定

原发肿瘤和邻近肺组织经病理学家分离后，通过物理和酶解方法分离，并从所得细胞悬液以及血液衍生的PBMCs中分选出了CD3、CD4和CD8阳性淋巴细胞亚群（图1A）。从TILs中分选出了PD-1阳性淋巴细胞。剩余的组织细胞悬液被冷冻保存。从所有T细胞亚群中分离出的基因组(g)DNA用作模板进行TCR-VDJ扩增和测序（TCRseq），以分析所有TIL和肺T细胞亚群的αβTCR库，具体方法见（图1A）。以患者1-3为例，通过比较肿瘤浸润与肺浸润克隆型的频率来确定候选的肿瘤特异性T细胞克隆型。基于高肿瘤频率和肿瘤特异性分布（肿瘤与非肿瘤频率比>5），预测CD8阳性克隆型为候选肿瘤特异性T细胞（图1B、C、D左图）。PD-1阳性TIL亚群中候选克隆型的高频率支持了这一选择（图1B、C、D中间图）。在患者1和2中，TILs采用内部方案（患者1，图S3）或从小规模快速扩增协议改编的临床TIL制造方案（患者2，图S4）进行了体外扩增。经过2到3周的培养后，扩增的TILs与自体肿瘤细胞进行挑战，并通过IFN-γ分泌测定--细胞富集和检测套件（Miltenyi，患者1，图S3）或FACS检测CD137表达（患者2，图S4）进行分选。肿瘤激活的IFN-γ和CD137阳性细胞进行了TCRseq，确定其频率并与起始时间点的前100个TIL克隆型进行比较（图1B、C右图）。在患者1中，8个候选肿瘤特异性克隆型中有6个显示了对肿瘤的反应性（图1B右图），在患者2中，10个预测的肿瘤特异性克隆型中有4个对肿瘤挑战有反应（图1C右图）。在这两名患者中，肿瘤反应性克隆型分别代表了之前确定的前6个（患者1，表2）和前4个（患者2，表3）克隆型候选者。已经证明了该方法可以通过比较TILs和正常组织驻留T细胞之间的TCRseq来预测肿瘤特异性克隆型，接下来利用TCR-T细胞方法分析了患者3的前4个预测的肿瘤特异性克隆型TCR。与患者1和2一样，患者3的TCR选择基于TILs的普遍性、高肿瘤与非肿瘤频率比以及PD-1阳性TILs中的高频率（图1D）。选定的TCR被指定为TCR-V1、-V2、-V3和-V4（图2A），并且TCR的CDR3序列比对显示TCR-V1、-V2和-V3之间有显著的序列同源性，表明它们具有共同的抗原特异性。肿瘤中的优势在外周血中并未体现，因为4个选定克隆型中有3个在外周血淋巴细胞中不存在，其中1个仅以低频率检测到（TCR-V2，0.02%，图1D，右）。TILs的单细胞RNA测序（scRNA-Seq）解码了选定克隆型的配对αβTCR链，并且单细胞基因表达分析揭示了这些细胞的功能特性和分化轨迹。TCR作为双顺反子嵌合表达构建体（cTCRs）进行合成，其中链的人恒定区被小鼠同源物替换（图2A），并克隆到载体pMX-puro中，用于健康供体T细胞的逆转录病毒感染。

图S3 患者1实验的大纲和时间表，包括手术标本制备、TILs和肺浸润淋巴细胞的MidiMACS分选、使用内部方案和高剂量IL-2及CD3/CD28磁珠扩增TILs，在第6天和TILs扩增后与自体肿瘤细胞挑战（d23）进行TCRseq。由于程序原因，第1天（基线，体外）未能进行TCRseq。5天的扩增可能改变了TILs和驻留肺T细胞的组成。然而，两种培养物并行进行，并根据以相同方式处理的两种培养物之间的比较TCRseq预测了候选的肿瘤特异性T细胞克隆型。为了测试其对肿瘤的反应性，使用IFN-γ分泌测定-细胞富集和检测试剂盒（Miltenyi）对扩增的TILs进行了检测。根据方案，一半扩增的TILs用肿瘤细胞刺激，另一半以相同方式培养但不进行抗原挑战。20h后，两种细胞培养物均用IFN-γ捕获试剂和IFN-γ检测抗体处理，并通过磁性细胞富集分离阳性细胞。分离的细胞进行TCRseq。从对照反应中未获得IFN-γ染色的淋巴细胞。

图S4 患者2手术样本的制备，TILs和肺浸润淋巴细胞的FACS分选，"小规模快速扩增方案"（REP）改编的TILs扩增，以及在基线（d1）和TILs扩增及与自体肿瘤细胞挑战后（d28）进行TCRseq。

表2 患者1（捕获的IFNγ阳性细胞）的前20个TIL克隆型：前20个TIL的频率（百分比）与原发肿瘤的其他部分以及扩增和肿瘤挑战后的比较

表3 患者2（捕获的CD137阳性细胞）的前20个TIL克隆型：前20个TIL的频率（百分比）与原发肿瘤的其他部分以及扩增和肿瘤挑战后的比较

图2 患者3的前4个预测的肿瘤特异性克隆型TCR

肿瘤特异性TCR-T细胞的生产及功能性鉴定

通过逆转录病毒转导供体来源的T细胞，使用合成的密码子优化序列编码TCR V1-V4（图2A），制备肿瘤特异性的TCR-T细胞。在逆转录病毒转导之前，通过CRISPR/CAS9介导的hTRBC和hTRAC结构域敲除（KO），去除受体T细胞中的内源性TCR，以防止内源性和重组TCR链的错配，这可能导致不可预测的不良特异性或对随后用于抗原筛选的同种异体抗原呈递细胞的异反应性。通过流式细胞术确认了成功的hTCR-KO和重组cTCRs的表达（图S5）。用cTCR-T细胞进行的IFN-γ-ELISpot测定表明，这些细胞能够识别患者3的肿瘤细胞（图2B,C）。当所有TCR-T细胞与HLA匹配的肿瘤细胞系进行测试时，只有TCR-V4 T细胞通过识别HLA-A*02:01匹配的肺癌细胞系MZ-LC-16作出反应（图2D）。由于HLA-A*02:01是两种肿瘤之间唯一匹配的等位基因，这一发现表明TCR-V4具有HLA-A02限制性，并提示患者3的肿瘤细胞和MZ-LC-16之间存在一种共同的目标抗原。通过泛HLA I类抗体W6/32的阻断实验，证明了所有4个测试TCR的I类MHC限制性。

图S5 流式细胞仪分析转导了肿瘤特异性TCR构建体的供体CD8 T细胞。

使用肿瘤特异性TCR-T细胞进行靶抗原筛选

新抗原与NSCLC患者对免疫治疗的有利临床反应有关。因此，为了识别肿瘤特异性非同义突变作为新抗原候选物，对肿瘤和邻近肺组织样本进行了比较性的全外显子组和转录组测序（图S6），鉴定了73个表达的非同义单核苷酸变异（SNV）和1个移码突变。结构变异分析未发现具有NSCLC亚型特征的易位。利用IEDB和NetMHC4.0公共数据库预测突变候选肽与患者I类HLA（HLA-A*01:01/*02:01，HLA-B*08:01/*40:02，HLA-C*03:04/*07:01）的结合情况，发现了581个IC50 <500nM和/或percentile rank<6的9-或10-肽。HLA等位基因相关的肽段根据亲和力评分进行排名，前94个高分肽段（以及2个QC肽段）被合成并测试其识别能力（表7）。K562细胞被转导患者的任一HLA I等位基因，并用候选肽段处理，通过ELISpot测定法检测TCR-T细胞的识别情况。表达任何TCR-V1、-V2和-V3的TCR-T细胞对KRAS Q61H肽段55-64 ILDTAGHEEY均有反应，无论CD4还是CD8阳性淋巴细胞是否表达TCRs（图3A,B）。TCR-V4-T细胞未能识别任何测试的突变肽段。由于之前已证明TCR-V4-T细胞对NSCLC系MZ-LC-16刺激有反应（图2D），怀疑患者3的肿瘤与该细胞系之间存在共享的靶表位。通过WES确定的非同义变异的比较分析未发现两种肿瘤中存在共享的突变新抗原（图S7A）。肿瘤与正常肺组织的差异基因表达分析显示两种肿瘤实体中有过表达的转录本（图S7B,C,D）。共享的过表达仅见于CT抗原CT83、MAGEA12和XAGEA1。通过ELISpot测定了TCR-V4-T细胞对共转染了抗原编码和HLA-A*02:01编码cDNA的293T细胞的反应性。然而，3个候选肽段均未被识别（图S7E），且未找到肿瘤特异性TCR-V4的同源抗原。

图S6 使用CLC Genomics Workbench工具进行外显子组(WES)和转录组(RNA-seq)分析流程概述。

表7 患者3肿瘤中发现的新抗原肽结合预测

图3 TCR-T细胞经过患者3-TCRs V1、V2、V3转导后，能够识别自然处理和呈递的KRAS Q61H肽55-64（ILDTAGHEEY）。

图S7 筛选TCR-V4-T细胞的目标抗原候选物。

表征3个不同的KRAS Q61H反应性TCR

为了更全面地分析3种突变(m)KRAS特异性的TCR，将表达TCR-V1、-V2或-V3的CD4阳性和CD8阳性T细胞与负载了不同剂量mKRAS肽55-64的K562/HLA-A*01:01细胞进行测试。所有TCR-T细胞在EC50值低于10nM的情况下显示出识别能力（图3C），无论这3种TCRs是在CD4还是CD8阳性TCR-T细胞中表达。为了验证mKRAS肽是否被处理和呈现，对NCI-H460细胞进行了识别测试。NCI-H460细胞自然携带KRAS Q61H突变（KRAS c.183A>T），但其HLA-A*01:01阴性，因此转入了该等位基因。通过ELISpot（图3D，E）和脱颗粒作为裂解活性的替代测定法（图S8），测试了野生型NCI-H460和NCI-H460/HLA-A*01:01细胞对TCR-T细胞的识别。如预期，NCI-H460细胞未引起任何反应，而NCI-H460/HLA-A*01:01细胞则被转导了任意一种TCR的CD8阳性TCR-T细胞强烈识别（图3D，F；图S8B，C）。相比之下，只有转导了TCR-V1的CD4阳性TCR-T细胞显示显著的反应性（图3E，图S8C）。TCR-V2和-V3转导的CD4阳性T细胞对NCI-H460/HLA-A*01:01的较弱反应表明，这些TCR转导的TCR-T细胞依赖于CD8共刺激。H-、K-和N-RAS蛋白家族成员从位置1到86具有相同的氨基酸序列（图S9A），这意味着包含氨基酸55-64的肽可以从这些蛋白质中的任何一种加工和呈递。RAS突变热点氨基酸位置61常见的改变包括Q61H、Q61R、Q61K和Q61L，在不同的肿瘤实体中以不同的频率发生（图S9B）。利用3个独立进化但不完全相同的KRAS Q61H特异性TCR（图2A），测试了这些TCR是否能够交叉识别其他替代突变。ELISpot实验使用转染了HLA-A*01:01和编码所有4种可能的mKRAS变异体以及野生型KRAS的cDNA的293T细胞，结果显示所有3个TCR都特异性识别Q61H突变（图4A）。作为KRAS Q61H是TCR实际靶标的最终证明，使用CRISPR/CAS9技术将NCI-H460/HLA-A*01:01细胞中的Q61H编码突变改为编码KRAS Q61R（KRAS c.181-183CAT>CGC；图S10）。由于NCI-H460细胞突变为纯合子，必须编辑两个等位基因才能影响TCR-T细胞的识别。处理后的肿瘤细胞通过限量稀释法进行了克隆，并在扩增后，多个克隆接受了TCR-T细胞识别测试。观察到的识别模式包括不变、减少和丧失识别。对每种模式的一个代表性肿瘤克隆的目标基因组区域进行测序显示，TCR-T细胞的识别与目标密码子编辑的程度相关（图4B）：编辑失败导致识别不变（克隆9），仅保留两个编码Q61H等位基因中的一个减少了识别（克隆11），而成功的双等位基因密码子编辑编码KRAS Q61R导致识别丧失。结果表明，所有3个TCR仅识别表达KRAS Q61H新表位的NCI-H460/HLA-A*01:01细胞，而不识别任何替代热点新表位，这表明具有严格的靶标特异性。关于交叉反应性，除了对相关肽没有反应外，TCR-T细胞对不同实验中使用的各种APC也没有反应，包括表达患者HLA等位基因的转染细胞，涉及K562细胞、293T细胞和一个HLA匹配的淋巴母细胞系。此外，在CrossDome数据库中搜索同源目标肽，未发现任何具有交叉反应潜力的肽。

图S8 CD107a表达表明突变KRAS特异性TCR转导的TCR-T细胞活化诱导的脱颗粒作用，作为T细胞细胞毒活性的替代指标。

图S9 Ras家族同工蛋白中第61位氨基酸突变

图4 TCR-T细胞经过V1、V2、V3 TCR转导后具有KRAS Q61H特异性。

图S10 CRISPR/CAS9 基因工程策略及结果显示在KRAS中Q61H突变被替换为Q61R。

患者随时间的KRAS Q61H反应过程及独立的KRAS Q61H阳性肿瘤中匹配TCRs的存在情况

与KRAS Q61H是NSCLC中的癌症驱动因子一致，该热点突变是克隆性的，并在原发肿瘤手术后32个月获得的肿瘤复发样本的基因组DNA中被检测到（表1，图S1）。使用复发FFPE样本的模板DNA进行TCRseq，检测到了多个预测来自原发肿瘤的肿瘤特异性克隆型，包括所有4个已确认的肿瘤反应性TCR（TCR-V1/V2/V3/V4）以最高频率存在（图5A）。此外，TCR-V1编码序列在2021年9月采集的血液样本的血浆cfDNA中通过TCR谱系测序被检测到（图S1；图5B），表明该克隆型在此时间点体内存在细胞周转。相比之下，该克隆型在同一时间点及三个月后的血液样本的PBMCs中未被检出。

为了进一步研究KRAS Q61H突变的免疫原性，对29名患者的各类KRAS Q61H阳性肿瘤的FFPE样本进行了TCRseq分析，这些患者包括14例肺癌、9例胃肠道肿瘤（包括CRCs、胰腺癌和胆管癌）以及6例未另行指定的肿瘤（图5C）。KRAS突变由19例中的SNVs c.183A>T和10例中的c.183A>C编码。对TRBV和TRAV序列的库分析显示，在29个患者样本中，有6个样本（4/14的肺癌样本）的CDR3序列与患者3的TCR-V1、-V2和-V3高度相关甚至相同。最常检测到的是4个样本（2例肺癌、1例直肠癌和1例其他癌症，图5C）中的TCR-V1的确切TRBV序列。在肺癌样本2中，除了匹配的β链外，还发现了TCR-V1的α链。该样本还包含与TCR-V3相关的α链。在FFPE样本3和5中，发现了多个与TCR-V2匹配的TRBV序列。然而，考虑到从石蜡材料中进行DNA/RNA测序存在许多伪影，在这些情况下只考虑了完全匹配和频率显著升高（>0.001%，覆盖度>4reads）的序列作为真实命中（图5C）。值得注意的是，在样本5中，一个与TCR-V2 β链完全匹配的序列占所有检测到克隆型的2.9%。综合来看，这些结果表明不同患者中的KRAS Q61H阳性癌症可能存在同源免疫受体的选择，提示该表位具有高免疫原性。

图5 TCR V1-V4阳性克隆型浸润P3复发肿瘤，在血浆和独立患者存档肿瘤样本中的同源TCR中检测到。

TILs的scRNA-Seq揭示了与细胞毒性、慢性刺激和耗竭一致的肿瘤特异性T细胞克隆型的分化轨迹

单细胞基因表达分析可以揭示TIL克隆型的活化和分化状态。分析了来自6名NSCLC患者的约13,000个单T细胞库，包括患者2和3（图1A）。为了选择肿瘤特异性克隆型候选者，应用了严格的阈值（肿瘤与非肿瘤比>10，CD8阳性TIL的绝对频率>0.2%）。在所有分析的TIL中，有160个克隆型（830个单细胞，6.4%）被该方法确认或预测为肿瘤特异性。对所有细胞进行无监督聚类，分离出了5个CD8阳性群和5个CD4阳性T细胞群（图6A，B）。在仅对CD8阳性T细胞进行子聚类后（图6C，约6600个细胞），在得到的5个群中的2个群（群0和2；图6C，D）中识别出了预测的肿瘤特异性克隆型，包括患者2和3中确认的肿瘤和KRAS Q61H特异性克隆型。具体来说，群2中的CD8阳性T细胞富集了与活化、细胞毒性及组织归巢相关的基因（颗粒酶，IFNG，CXCL13，CXCR6），但也富集了与终末分化和耗竭相关的基因（LAYN，TOX，PDCD1，HAVCR2，ENTPD1等；图6D，F）。作为对照，预测扩增的旁观者T细胞克隆型（肿瘤与非肿瘤比<1，频率>0.1%）通过条形码定位（图6E），主要分布在群1和4中，在群0中很少见，并且在群2中几乎不存在。对肿瘤特异性克隆型的单细胞详细分析显示了从效应记忆/驻留记忆到终末分化/耗竭T细胞的分化轨迹，表明这些T细胞已被肿瘤细胞激活，并最终因慢性抗原刺激而耗竭。因此，对于基于大频率、高肿瘤与非肿瘤频率比和PD-1表达选择的顶级克隆型，其基因特征表明耗竭/功能失调的T细胞支持了这一选择。

图6 6例NSCLC患者肿瘤浸润淋巴细胞的单细胞基因表达分析，结合条形码介导的预测和确认的肿瘤特异性克隆型检测。

总结

采用工程化的肿瘤反应性TCR-T细胞的过继细胞治疗扩大了实体瘤的细胞治疗选择。与CAR相比，TCRs能够识别显著更大的抗原库，并且TCR-T细胞能够以更高的敏感性识别目标表位。TCR-T细胞的更高功能亲和力赋予其更强的杀伤肿瘤细胞的能力。同时，较低的目标结合亲和力使其能够连续扫描和杀伤多个肿瘤细胞。在治疗环境中，这种特性可能会延迟耗竭并增加TCR-T细胞的持久性。目前处于临床开发阶段的TCR-T方法共同的特点是它们受到抗原中心视角的驱动。这些方法要么针对非常有限数量的抗原结合少数常见的HLA，主要是HLA-A*02:01，要么在个性化方法中，它们专注于针对个体新抗原的TCR。这两种策略都局限于少量符合条件的患者。

在这项研究中，提出了一种抗原不可知的方法来识别肿瘤特异性的T细胞克隆型，该方法基于①在TILs中的数值优势，②高肿瘤与非肿瘤频率比，③PD-1表达，以及④通过单细胞基因表达数据验证克隆型选择，显示候选克隆型表达慢性激活、终末分化和/或耗竭的基因特征。与竞争性研究仅使用单细胞表达谱从TILs或外周血中鉴定肿瘤特异性T细胞相比，评分矩阵有助于从免疫优势克隆型中直接筛选治疗性TCR。基于4个资格条件的组合选择可能比基于单一属性的选择更有可能说服监管机构批准在临床试验中测试肿瘤特异性TCR候选物。该方法的有效性在3名患者中得到了证实，显示预测的top肿瘤特异性克隆型具有肿瘤反应性。并非所有最初预测的肿瘤特异性TILs（患者1,2，图1B,C右）都被扩增并对肿瘤挑战产生反应，这可能直接归因于T细胞的耗竭。在患者3中，使用前四种克隆型的TCR生成的TCR-T细胞被证明是肿瘤特异性的，其中3个TCR识别了KRAS Q61H的新表位。5名额外患者的预测肿瘤特异性克隆型通过单细胞RNA测序确定的分化轨迹一致。

关于KRAS表位的临床相关性，TP53、EGFR和KRAS的驱动突变在与吸烟和非吸烟相关的肺癌中始终代表克隆（或主干）突变。该表位在所有肿瘤细胞中的表达结合其高免疫原性使得KRAS Q61H表位成为免疫治疗的有吸引力的目标。免疫原性通过以下事实推断：同源的NRAS突变（ILDTAGKEEY、ILDTAGREEY）已在HLA-A*01:01阳性的黑色素瘤患者中显示出免疫原性，并且肽的呈现已通过免疫肽组学证实。研究中，发现了3个独立的T细胞克隆型，具有强烈亲和力针对表位ILDTAGHEEY，并在其他患者的KRAS Q61H阳性肿瘤中发现了高度同源的TCR。此外，在复发病灶中重新发现了所有TCR，并且其中一个甚至在手术切除原发肿瘤近三年后的循环游离DNA中被检测到。抗原性肽由HLA-A*01:01呈现，该分子在TCGA数据库中23.7%的肿瘤中表达。与其他KRAS驱动突变相比，如G12热点突变，Q61H突变较为罕见（根据TCGA数据，分别发生在肺、结直肠和胰腺癌中的比例为0.2%、0.7%、2.8%），这可能解释了为什么这种免疫原性表位至今未被发现。然而，鉴于上述肿瘤在欧洲和美国的高发病率，每年将有数百名患者有资格接受表达这些TCR的TCR-T细胞的ACT治疗。可以预期，临床反应将类似于使用转导KRAS G12突变特异性TCR的TCR-T细胞治疗少量患者所报告的结果。

总之，所报道病例中发现的肿瘤特异性且能识别突变KRAS的TCR表明，该识别和筛选肿瘤特异性TCR的策略可以应用于许多不同肿瘤患者，前提是具备用于分析的手术材料。天然TCR的合成与克隆以及利用这些TCR制造自体T细胞用于治疗性应用预计是安全的，因为这些能够识别肿瘤的克隆型已经在胸腺选择过程中通过了筛选，并在体内处理了肿瘤而没有明显的不良反应。此外，每名患者使用3-4种主要肿瘤特异性TCR进行T细胞过继转移可以应对肿瘤异质性并对抗免疫逃逸机制。然而，尽管开发这种个性化的TCR-T细胞产品是可行的，但从制造和监管的角度来看，临床实施具有挑战性。然而，克服这些挑战是值得的，因为从TILs中直接筛选肿瘤特异性TCR的方法可以使更多实体瘤患者有资格接受TCR-T细胞治疗，而不是依赖于抗原中心的选择方法。

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