CRISPR检测技术：CreDiT如何为资源不足地区带来变革

低中收入国家（LMICs）在全球由HPV引起的癌症发病中占比超过80%，这一比例远高于其他地区。在这些地区，宫颈癌筛查工作受到地理、社会经济因素的限制，以及病理学上的难题。因此，能够及时且准确地识别出高危型HPV（hrHPV）对于解决这些挑战至关重要。与传统细胞学检测相比，PCR等分子诊断技术在灵敏度和特异性上具有明显优势。然而，这些技术在成本和基础设施方面的高要求限制了它们在中低收入国家的普及，这使得开发即时诊断（POC）解决方案以支持"筛查和治疗"策略变得尤为迫切。

基于CRISPR的检测技术已经成为核酸（NA）检测的有力工具，因为它们能够实现序列特异性信号放大。来自美国马萨诸塞州总医院研究所系统生物学中心的研究人员基于CRISPR系统开发了一种即时检测（POC）技术---CreDiT（CRISPR增强数字检测），专门用于分散的HPV检测和筛查HPV相关癌症。他们的成果发表在Nature Communications（IF：14.7）杂志上，标题为 "Empowering the on-site detection of nucleic acids by integrating CRISPR and digital signal processing"。

CreDiT技术通过融合Cas反应和数字无线电通信信号读出技术，实现了快速、恒温、单管的HPV检测，具备了卓越的信号检测稳定性和抗噪声能力。该技术旨在检测高危HPV基因和癌蛋白mRNA，能够同时处理多达12个样本，并在35分钟内精确检测到低至单拷贝的HPV DNA靶标，同时对临床宫颈和肛门样本中的高危HPV类型进行分类。CreDiT检测的多功能性使其成为临床诊断中极为宝贵的工具，特别是在资源有限的环境中。

一、CreDit 平台的构建

作为一种无需外部中断的创新一体化检测技术，CreDiT能够同时扩增目标DNA并分析信号。在CreDiT检测的初期，聚合酶将双链靶DNA分离，形成单链区域供gRNA分子识别。识别成功后，Cas12a酶的核酸酶活性被触发，进而切割F-Q DNA探针，产生荧光信号。整个检测流程在恒定温度下完成，提高了样品处理的效率。研究人员还开发了一种专门用于多样本测量的便携式自动测试系统，确保信号检测的一致性。该系统体积小巧，尺寸为14 × 11 × 6.5 立方厘米，使得CreDiT检测方法有潜力在资源有限的环境中进行床旁检测，满足快速、精准检测hrHPV的需求，尤其是在服务不足的地区。

图1 CreDiT用于人乳头瘤病毒检测

二、用于 POC 操作的光学检测

在设计护理点（POC）设备时，为了降低设计复杂性和成本，设计者常常会通过减少组件数量来实现。尽管这可能会影响系统的准确性和分析性能，尤其是在荧光设备方面。CreDiT光学系统通过利用沃尔什-哈达玛德变换（WHT），与数字电子设备本质上兼容，采用快速、轻便的算法（FWHT），仅需实数加减运算，从而在性能上超越了传统的简单光学设置。WHT的灵敏度更高，检测限比传统方法低约2200倍，并且与商业读板器的检测结果有极强的相关性。

三、CreDiT 温控

为确保 CreDiT 反应的一致性，研究人员为检测装置设计了精确的温度控制。研究人员优化了样品支架的设计，以便对所有 12 个样品进行快速、均匀的加热。此外，还设计了铝制支架，以确保装置比固体支架加热更快。在这基础上，他们确定了一个适应不同化验步骤的精确温度。在整个化验过程中观察到一致的热量分布，证实了所有 12 个样品的温度均一性。

图2 CreDiT系统的构建

四、POC 操作的化验优化

为了优化 CreDiT 检测的工作流程，研究人员使用酶细胞消化法对核酸提取过程进行了微调，这种方法无需外部仪器，只需调节温度即可控制。研究人员将这种优化方案与标准提取方法进行了比较，对两种方法提取的核酸都进行了 PCR 和 CreDiT 分析。结果发现，两种方法提取的核酸质量、PCR条带强度、提取率上都较为相似。

科学家们进一步探讨了在常温下保存样本和试剂的可行性，这对于在中低收入国家（LMIC）推广CreDiT技术至关重要。他们将细胞置于提取缓冲液中，在4°C或室温条件下储存，观察到两周内核酸产量并未显著减少。同时，为了简化存储和运输流程，他们对CreDiT试剂进行了冻干处理，实验结果显示，即使在室温下，试剂也能维持至少两周的有效性。这些发现证实了CreDiT技术即使在资源受限的环境中也能应用，无需依赖冷链物流，增强了其实用性和操作性。

图3 POC应用的检测优化

五、CreDiT 探针的设计与验证

科学家们为了检测高危人乳头瘤病毒（hrHPV），开发了一套全面的CreDiT探针库，专门针对特定的DNA序列。在验证过程中，他们对CreDiT检测试剂进行了优化，确保只有在所有必需成分和目标DNA同时存在时，才能产生CreDiT信号。在与qPCR和两步合成HPV16 DNA检测方法的性能比较中，CreDiT显示出更高的灵敏度。CreDiT的检测速度也更快，仅需20分钟，相比之下，qPCR需要1小时，两步检测法需要50分钟。经过CreDiT检测和凝胶电泳验证，CreDiT在特异性和交叉反应方面的表现证明了其作为hrHPV检测诊断工具的潜力。

图4 CreDiT 探针设计

六、CreDiT 方法确证

为了评估 CreDiT 与其他检测方法的一致性，研究人员对整个 CreDiT 检测流程进行了评估。他们应用不同 HPV 亚型的宫颈癌细胞系来评估更多的 hrHPV 探针，CreDiT只检测到了目标信号。此外，CreDiT 还通过加入逆转录酶用于 mRNA 目标检测，在定性和定量分析中产生与 RT-PCR 一致的结果，从而有助于识别高危病例并最大限度地减少过度治疗。

七、CreDiT 临床测试

在研究的最终阶段，科学家们采用CreDiT技术对宫颈或阴道涂片中提取的样本进行了HPV状态的检测。在利用qPCR方法评估样本的HPV状况后，他们对剩余样本进行了CreDiT分析。CreDiT技术成功地识别了HPV阳性和阴性样本，并准确地检测出了三种主要的高危HPV类型（HPV16、HPV18和HPV45），与临床诊断结果相吻合。

CreDiT在诊断这三种主要的高危HPV目标时展现了极高的准确性。为了进一步验证CreDiT的临床应用潜力，研究人员还将该技术应用于肛门巴氏试验样本的分析，在肛门癌病例的HPV检测中，CreDiT的结果与临床诊断高度一致，这强调了CreDiT作为一种可靠和精确的HPV筛查工具在不同临床环境中的应用前景。

图5 使用细胞样本进行 CreDiT 表征检测

图6 临床样本分析

综上，基于 CRISPR 的 CreDiT 旨在为低收入国家提供低成本、分散化、自动化和快速读取结果的分子诊断。它的设计具有几个主要特点：首先CreDiT 的灵敏度是 PCR 的 100 倍，以单管形式运行，并保持 42°C 的恒温。其次，该系统无需 PAM 序列，可检测多种 hrHPV 目标，从而适应各种临床需求。此外，新型数字方法的使用提高了信噪比和计算效率，使 CreDiT 更适合于床旁应用。

提升CreDiT技术的实用性在未来还将面临更多挑战。研究人员在这项研究中提出了多种建议，如扩大探针库以覆盖更广泛的HPV亚型、在单个反应管内进行多重检测，以及简化检测流程，以便更易于使用。最终目标是将CreDiT部署到低中收入国家进行现场评估，并与当地医疗供应商合作，帮助完善该平台，确保其满足这些地区特定的临床、经济和环境需求。CreDiT的最终愿景是成为一种实用的、可实地部署的CRISPR检测HPV的解决方案，使最需要的地区也能进行最先进的筛查。

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