Ä文献｜与糖同行，IAPP和糖尿病不能不说的事

糖，一个很甜的字。可对于糖尿病患者来说，"糖"是会致命的毒药。今天小编带来的文献主角是人胰岛淀粉样多肽(IAPP)，文中介绍了IAPP与2型糖尿病的作用机制。

IAPP聚集机制与II型糖尿病关联

糖尿病会导致高血糖和胰岛素抵抗。作为一种负反应，激素的过度产生开始了。这些激素包括胰岛素和胰岛淀粉样多肽(IAPP)，它们在胰腺中共表达并从胰岛素颗粒中共分泌。这些激素，特别是IAPP的过量产生与蛋白质聚集的开始和随后的β细胞功能障碍有关。

IAPP，也称为胰淀素，是已知的最能产生淀粉样蛋白的肽激素之一。在其生物活性形式中，人类胰岛淀粉样多肽(IAPP)的聚集与II型糖尿病有关。在分子水平上对这种关联进行定量理解，需要从潜在的微观方面解析IAPP的聚集机制。在这里，作者系统地研究了具有氧化形式且C端酰胺化、3位和7位残基之间有二硫键的重组IAPP，使用硫黄素T荧光监测淀粉样纤维形成随时间和IAPP浓度的变化。作者使用全局动力学分析将聚集的宏观测量结果与微观机制联系起来，并表明新聚集体的生成主要由纤维表面单体的二次成核所主导。然后将胰岛素瘤细胞暴露于从聚集过程的不同时间点提取的等分试样中，发现在反应的中点，即二次成核速率达到最大值时，毒性最高。这些结果表明IAPP寡聚体是IAPP聚集过程中产生的毒性最强的物质，并表明针对IAPP二次成核的化合物可能作为II型糖尿病的治疗候选药物最为有效。

IAPP单体纯化与聚集动力学研究

为了研究参与IAPP聚集的微观过程，作者需要制备IAPP的单体，通过探索缓冲液组成、pH、温度和填料选择等多种条件。作者发现刚性烯丙基右旋糖酐/双丙烯酰胺基质（如Tricorn10/300GLSephacrylS-100HR柱）与IAPP的相互作用最小，使得目标样品单体与聚集体的良好分离，并能够分离均匀的样品（图1）。初始的HiPrep16/60SephacrylS-100HRSEC结果显示存在更高级的结构以及单体IAPP（图1A、B）。将含有单体IAPP的组分合并，并对它们进行另一轮尺寸排除（使用Tricorn10/300GLSephacrylS-100），获得非常纯的单体IAP样品，纯化流程见图2。通过该方案，初始条件得到了很好的控制，作者研究IAPP聚集动力学并推导聚集的分子机制（图1C、D）。

图1：单体重组IAPP的纯化。

(A)使用HiPrep16/60SephacrylS-100HR柱在35mM乙酸钠缓冲液(pH5.3)中的SEC纯化的色谱图。(B)SDSPAGE，使用SEC后获得的级分的Tris-Tricine凝胶（10-20%聚丙烯酰胺），如(A)所示。收集、合并含有单体IAPP（用星号表示）的级分，并冷冻干燥另一轮SEC。(C，D)色谱图和SDSPAGE来自第二次SEC纯化，使用SephacrylS-100HRTricorn10/300GL柱在35mM乙酸钠缓冲液中，pH5.3

图2：单体重组IAPP纯化流程图

作者在制备了IAPP单体后开展了一系列的IAPP聚合研究。IAPP聚合机制如图3所示。单体最初通过主要途径聚集（主要成核和延伸）。一旦形成了临界量的原纤维，二次成核的催化性质就成为聚集过程中产生低聚物的主要过程。在表中，计算了5µM样品在33mM醋酸盐、150mMKCl、pH5.3中通过初级和次级途径形成聚集体的速率。

图3：IAPP聚集反应途径的示意图。

单体最初通过主要途径（初级成核和延伸）聚集。一旦形成了一定量的原纤维，二次成核的催化性质在聚集过程中生成低聚物时成为主导过程。在表格中，计算了在33mM醋酸盐、150mMKCl、pH5.3条件下5µM样品通过初级和次级途径形成聚集体的速率。Aβ42在20mM磷酸钠、pH8.0以及Aβ40在20mM磷酸钠、pH7.4中的速率常数来自（Cohen等人，2013；Meisl等人，2014）。

为了研究IAPP聚集反应过程中产生的聚体的生物活性，进行了三种不同的细胞生物学测定。胰岛素瘤细胞暴露于在聚集反应的不同时间点采集的IAPP样本（图4）。这些样品包括：

1 、聚集过程开始时的IAPP，其中它主要是单体的(t0)；

2、IAPP在聚集过程的t1/2处，其中存在大量的低聚物，预计将与单体和原纤维共存；

3、聚集过程结束时的IAPP，2.4t1/2，其中主要存在原纤维物种（但保留了较小部分的低聚物和单体）。

评估了来自聚集时间过程中三个不同时间点的样品在早期或晚期细胞毒性读数引起细胞功能障碍的能力。

图4：描述了对暴露于正在进行的IAPP聚集反应样品的细胞的毒性测量。(A)在聚集的时间过程中，在反应开始时IAPP物种为单体(t0)、反应中期IAPP约为一半单体和一半原纤维且存在低但显著水平的低聚物(t1/2)以及反应结束时样品主要是原纤维但可能仍存在一些低聚物(2.4t1/2)的样品被取出，并与胰岛瘤细胞一起孵育以评估其毒性。(B)代表性图像显示了在不同时间点用IAPP物种处理后的胰岛瘤细胞的Fluo-4或Hoechst33,342的荧光。(C)Fluo-4的荧光强度表明在不同时间点用IAPP物种处理的细胞的Ca2+内流水平。(D)凋亡标志物Hoechst33,342对于在不同时间点用IAPP物种处理的细胞的荧光强度。(E)通过CellTiter-Glo测定评估用不同时间点的IAPP物种处理24小时的细胞的活力

小结

通过一系列的研究，作者做出了如下总结：

重组IAPP在静止条件下的聚集过程主要由原纤维表面催化的二次成核决定。

此外，从二次成核产生的低聚物种似乎对胰岛素瘤细胞具有显著毒性。

这些结果为II型糖尿病患者IAPP的聚集与β细胞的死亡之间的联系提供了可能的理论基础。因此，这项研究将IAPP寡聚物确定为II型糖尿病药物发现的重要靶点，并表明二次成核抑制剂的设计可以作为一种治疗方法，在这种疾病中保护或恢复β细胞的功能。

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