个性化新抗原TCR-T细胞治疗转移性CRC的2期临床中期结果

新抗原反应性T淋巴细胞进行过继细胞转移(ACT)可以介导癌症消退。在这里，Steven A. Rosenberg团队近日在Nature Medicine (IF 58.7)公布了一项个性化新抗原TCR-T细胞治疗转移性CRC的2期临床中期结果（NCT03412877），从转移性胃肠癌患者的肿瘤浸润淋巴细胞中分离出独特且个性化的新抗原反应性TCR，并将TCR α和β链整合到γ逆转录病毒载体，转导自体PBL，并在淋巴细胞耗竭化疗后将TCR-T过继转移到患者体内。治疗了7例转移性错配修复功能正常的结直肠癌患者，这些患者在多次既往治疗后出现疾病进展。该研究的主要终点是根据RECIST 1.1测量的客观缓解率，次要终点是安全性和耐受性。本研究中没有预设的中期分析。根据RECIST标准，3名患者具有客观的临床反应，包括持续4-7个月的肝、肺和淋巴结转移消退。所有患者接受了含有≥50% TCR转导细胞的T细胞群，所有T细胞群都具有多功能性，与野生型相比，其特异性地对突变肽产生IFNγ、GM-CSF、IL-2和颗粒酶B的分泌。在ACT后1个月，在5名患者(包括3名应答者)的外周血中检测到TCR转导的细胞，CD3+细胞水平≥10%。在1名对治疗有反应的患者中，约20%的CD3+PBL在治疗2年后表达转导的TCRs。这项研究提供的早期结果表明，在转移性结直肠癌患者中用基因修饰以表达个性化新抗原反应性TCRs的T细胞的ACT是耐受的，并且介导肿瘤消退。

在癌症发展过程中，肿瘤积累遗传异常，包括点突变、阅读移码突变、终止密码子突变、DNA插入和缺失和/或染色体易位，所有这些都会导致变异蛋白的产生。其中一些可以加工成小肽或新表位，在MHC分子的背景下呈现在细胞表面，并被T淋巴细胞识别。这些新抗原代表理想的肿瘤相关T细胞靶标，因为它们不在正常组织中表达。团队之前的研究表明，约80%的胃肠癌患者的肿瘤内含有新抗原反应性T淋巴细胞。还观察到，只有1-2%的突变具有抗原性，除了极少数例外，所有特定的HLA限制性新抗原决定簇对自体患者都是独有的。

先前的试验中，患者接受了使用逆转录病毒修饰的PBLs进行的ACT治疗，这些淋巴细胞表达针对非突变肿瘤相关蛋白的TCRs，包括MART-1和gp100以及NY-ESO-1。这些研究表明，TCR转导的淋巴细胞可以在患有恶性黑素瘤和滑膜肉瘤的患者中介导肿瘤消退，并且在治疗后能在体内长时间存活。然而，针对非突变抗原（如MART-1、gp100、CEA和MAGE-A3) 的TCR转导PBLs治疗的患者出现了主要的on-target/off-tumor，强调需要开发针对肿瘤细胞的新抗原定向疗法。

为了解决T细胞分化和旁观者细胞过度生长带来的挑战，这里启动了2期单臂临床试验，对任何类型的转移性癌症患者使用经过基因改造以表达新抗原反应性TCR的自体PBL进行治疗。在这里，报告了ACT的生产和特性分析，以及这项试验的早期发现，特别是关注错配修复（MMR）功能正常的结直肠癌患者。没有预设的中期分析，但报告这些早期结果很重要，因为这里描述的患者反应证明了针对随机体细胞突变的个性化TCR策略可能导致肿瘤消退这一原理，这在之前尚未有报道过。

临床试验

文中所述的患者在2018年9月-2023年3月期间参加临床试验，研究仍在进行中。转移性上皮癌的患者接受了经过基因改造的自体PBL治疗，PBL被设计表达来源于TILs的个性化新抗原反应性TCR。这里生产了GMP标准的逆转录病毒，编码TCRα和β链，转导患者的PBLs，并在预处理后（包括环磷酰胺和氟达拉滨组成的非清髓性淋巴细胞耗竭化疗方案）回输到患者体内。患者还从细胞转移前开始接受4次pembrolizumab单抗治疗，每3周一次，并在高剂量IL-2支持下耐受性地接受细胞因子治疗。用个性化新抗原反应性TCR转导的PBLs对7名转移性MMR功能正常的结直肠癌患者进行了一线ACT治疗（表1），所有患者之前都至少接受过两个疗程的化疗。

表1 患者治疗概要

新抗原反应性TCR的鉴定（两种方法）

这里使用2种方法来鉴定新抗原反应性TCR。在第一种方法中，每个患者都经历了转移病灶的切除。在高剂量IL-2存在的情况下，肿瘤被切割成小碎片，T细胞从碎片中迁移并扩增。同时，从肿瘤和正常PBL中分离DNA和RNA，并进行全外显子组测序(WES)和转录组测序(RNA-seq)以鉴定体细胞突变。然后，通过将TIL与自体DCs共培养来筛选每个体细胞突变体，以识别来自每个TIL片段的T细胞，所述DC负载有串联微基因(TMG) RNA或编码所有突变的合成肽。然后根据激活标志物(4-1BB和/或OX40)的上调从反应性片段中进行单个T细胞的FACS，并进行cDNA的靶向测序，以鉴定TCR α和β链。构建并评估编码潜在TCRs的逆转录病毒载体。这些载体中，人TCR Vα和Vβ链接到鼠恒定区，以防止与内源性TCR的错配。该策略如图1a所示，这是用来为7名患者中的6名(4293、4367、4378、4405、4469和4484)确定TCR的方法。

作为这种新抗原TCR发现平台的一个例子，对于患者4378，针对125个突变筛选了24个TIL片段培养物，并鉴定了似乎含有CD8+ T淋巴细胞的多个细胞群，其在最初的筛选试验中识别TMG1和TMG2(图1b)。通过评估由TMGs编码的单个25aa肽段的识别来对TMG进行去卷积 (图S1 代表性结果F18和F12)，并鉴定了新抗原、突变体GCLM (TMG1)【一种参与谷胱甘肽合成的酶】和突变体ALDH2 (TMG2)【一种参与酒精代谢的醛脱氢酶】。为了鉴定突变型GCLM反应性TCR，将TIL片段与TMG1电穿孔的DC共培养(图1c)，分选单个CD8+ 4-1BB+ T淋巴细胞，并鉴定出一个显性TCR：TRAV2/TRBV7-9。类似地，为了鉴定突变型ALDH2反应性TCR，将TIL片段与TMG2电穿孔的DC共培养(图1d)，分选单个CD8+ 4-1BB+ T淋巴细胞并鉴定出一个显性TCR：TRAV41/TRBV20-1。对于这些TCR中的每一个都构建逆转录病毒载体，转导来自健康供体的PBL并测定相关TMGs和突变体和野生型25aa肽的IFNγ分泌(图1c,d)。TRAV2/TRBV7-9 TCR识别突变GCLM，TRAV41/TRBV20-1 TCR识别突变ALDH2 (图1c,d)。此外，使用NetMHCpan MHC结合预测算法，从突变GCLM和ALDH2中制备了一系列短肽，预测其以高亲和力与患者的每种HLA I类分子结合，评估识别并鉴定最小表位(图S3a)。最后，通过将短肽脉冲到用每个患者的HLA I类分子瞬时转染的COS-7细胞上，鉴定这些表位中每一个的特异性HLA限制(图S3b)。

图1 鉴定新抗原反应性TCRs。

图S1 4378 TMG1和TMG2反应性的去卷积

图S3 4378 GCLM和ALDH2最小表位和HLA限制性的鉴定

在为患者4420确定新抗原反应性TCR的第二种方法中，从切除的肿瘤中制备了单细胞消化液，并按照Steven A. Rosenberg团队2023年发表的Cell surface marker-based capture of neoantigen-reactive CD8+ T-cell receptors from metastatic tumor digests的方法【也可参考《快速实现个体化TCR-T细胞治疗》和《抗肿瘤新抗原反应性T细胞的分子特征》】对表达CD8、PD-1、CD39和TIGIT的单个T细胞进行分选和测序，以确定潜在的TCR α和β链。构建包含这些TCR的逆转录病毒载体，并对转导的PBL进行筛选，以检测新抗原反应性。鉴定了6个潜在的TCR，其中一个介导识别参与将分泌囊泡定位到细胞膜特定对接位点的突变EXOC4蛋白。

7名患者中有5名接受了仅来自HLA II类限制性CD4+ T细胞的TCR（表3），其中1名患者(4405)对治疗有部分缓解，持续了7个月。相反，2名接受仅来自HLA I类限制性CD8+ T细胞的TCR的患者(4378和4420)对治疗有反应。

表3 TCR鉴定

为了确定鉴定的TCRs是否具有在体内识别肿瘤细胞的潜力，评估了来源于原始肿瘤切除的癌细胞中特定突变基因的表达。这是通过WES估计每个样本中携带突变的肿瘤细胞的百分比，并通过RNA-seq(表2)估计突变基因表达的水平来完成的。在这7名患者靶向的10种新抗原中，5种似乎是克隆性的(4293 TP53，4367 PIK3CA，4378 ALDH2，4405 MAGED2和4420 EXOC4)，其中4种在RNA-seq表达的前2个四分位数内(除了4367 PIK3CA)。其他5个靶点似乎是亚克隆的，在不同的样品中具有可变的CCF值(4378 GCLM，4469 CREG1和4469 PLEC)或在所有测序的片段中具有低CCF值(4293 SMC3和4484 STK10)。总的来说，在7名患者的5名中，发现靶向至少一个克隆突变(4293、4367、4378、4405和4420)，其中3名(4378、4405和4420)对治疗有反应。在2名患者中没有观察到临床反应，对他们施用的TCRs仅靶向亚克隆突变(4469和4484)。

还对肿瘤样本进行了HLA杂合性丢失（LOH）的评估，并发现一个样本有明确的HLA I类LOH证据（4469；表2）。尽管此患者对治疗没有响应，但他接受了两种限制于HLA II类的CD4衍生TCR治疗，因此不清楚这种HLA LOH是否对治疗产生了负面影响。

表2 T细胞治疗前切除肿瘤中新抗原和HLA的表达

生产和表征临床级逆转录病毒上清液及T细胞产品

这项临床试验与所有其他使用γ逆转录病毒的基因疗法试验的一个主要区别在于，它使用了从瞬时转染的293GP细胞产生的逆转录病毒产物（图ED1）。在其他试验中，需要大量上清液来用单一产品治疗多个患者，而美国FDA要求生成稳定的包装细胞系。对于生产用于单个患者治疗的小规模个性化产品的过程来说，建立和验证这些细胞系以及后续的逆转录病毒产物是不切实际的。因此，这里开发了经美国FDA批准的工艺，通过在GMP条件下用含TCR和RD114 env的质粒瞬时转染293GP细胞，在内部生产小批量的逆转录病毒产物。为每个TCR单独生成载体上清液，并在内部完成了所有即时临床使用所需的质量控制测试。所有载体都通过了所有质量控制测试（表4和表5）。

图ED1 临床级逆转录病毒产品的生产。使用瞬时转染的293GP细胞产生逆转录病毒产物以转导PBL用于患者治疗的GLP方法的示意图。

表4 临床级上清液的表征

表5 临床级逆转录病毒产品的质量控制测试

为了生成TCR转导的细胞制品，解冻冷冻保存的PBMCs并用IL-2和anti-CD3刺激，并在2天后使用GMP级逆转录病毒制品进行转导。对于部分患者，在转导前通过去除表达相反共受体的细胞来富集CD4+或CD8+ T细胞。初始刺激后的10天，用辐照的饲养细胞、IL-2和anti-CD3再次刺激转导细胞，以进一步扩增细胞。接着，在第二次刺激后的14天，收集细胞，如果生成多个TCR群体，则将它们合并，并过继转移到自体患者体内。所有给予患者的细胞制品都按照COA的标准通过了包括无菌性、效价和存活率测试在内的所有释放检测标准。此外，所有最终细胞制品的载体拷贝数均在细胞COA限制的平均每个细胞≤5个拷贝范围内（表6）。

表6 输注细胞产物的表型表征

小鼠和人类的多项研究表明，具有较低分化表型的肿瘤特异性T淋巴细胞在诱导肿瘤消退方面比耗竭的细胞更有效。为了确定表型特征是否与临床反应相关，通过评估TCR转导细胞上CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、CD27、CD39和CD69的表达，对过继转移的新抗原反应性TCR细胞产品进行了表型鉴定。图2a显示了来自患者4378的GCLM和ALDH2 TCR的流式细胞术分选策略示例。总体而言，不同患者和不同TCR之间的TCR转导效率存在显著差异，范围从约22%到84%（表6），但未观察到与患者反应的明显关联。在所有患者中，大多数输注细胞具有效应记忆表型（CD45RO+CD62L-）并且不表达CD27，这是一种与分化程度较低的细胞相关的标志物（表6）。关于CD39和CD69，患者间的差异显著，双阴性细胞比例在TCR转导细胞中从11%到76%不等。有趣的是，接受CD8衍生TCR的2位患者（4378和4420）对其TCR治疗有部分临床反应，而这2位患者体内转移的TCR转导细胞中含有最高比例的CD39-CD69-细胞。

还评估了用于转导的治疗前PBL表型（图S4），尽管患者之间存在相当大的差异，但没有标记物与临床反应相关。

图S4 用于转导的治疗前PBL的表征

对每一种转移的细胞制品进行了功能评估，通过测定在不同浓度的突变型和野生型肽刺激下产生的IFNγ来评价。图2b显示了患者4378的GCLM和ALDH2 TCR组合产品的该检测示例。所有T细胞制品都显示对突变肽具有特异性（图2b和图S5）。除了IFNγ，还测定了IFNα、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17α、IL-21、TNFα、颗粒酶B、穿孔素以及MCP-1在共培养上清液中的含量。图2c显示了4378产品这些检测的示例。每个患者的细胞制品都针对突变肽特异性地分泌GM-CSF、IL-2和颗粒酶B（图2c和图S6）。对于其他所有细胞因子、趋化因子和穿孔素，注意到患者间存在显著差异，但没有发现与临床反应明显相关性。

图2 用于患者治疗的TCR转导细胞的表征。

图S5 输注细胞的功能特征

图S6 输注细胞的功能表征：多种细胞因子分析

临床反应

对7名患有转移性MMR功能正常的结直肠癌患者使用了个性化的新抗原反应性TCR转导的PBLs作为一线ACT治疗（表1）。其中3名患者（4378、4405和4420）根据实体瘤反应评估标准RECIST 1.1准则，经历了短暂的部分缓解，包括肝脏、肺部和淋巴结的转移病灶缩小（图3）。中位无进展生存期为4.6个月。所有患者在病情进展时退出研究，寻求其他标准或实验性疗法。

图3 新抗原反应性TCRs的逆转录病毒转导自体PBL治疗的临床反应。

毒性

患者4367经历了4级重度CRS，这被归因于细胞和IL-2，通过包括类固醇和托珠单抗在内的支持性护理得以解决，患者在第21天康复出院。所有患者如预期那样，由于治疗的淋巴耗竭设计，出现了3/4级血液学毒性。一名患者出现暂时性的急性出血倾向，通过输血和血液制品治疗后得到解决。没有发生与治疗相关的死亡。

输注后PBL的探索性分析

针对每位患者，评估了治疗后PBMC中TCR转导细胞的持久性和T细胞扩增峰值（Cmax）。对患者4378的GCLM和ALDH2 TCR的流式细胞术分析策略作为一个例子。在7名患者中，有5名在所有可用PBMC样本的时间点，都能够检测到TCR转导细胞（图4）。对治疗没有反应的4293和4367患者，在ACT后第41天的PBL中，未能可靠地检测到TCR转导细胞。对于T细胞扩增峰值，估计了ACT后指定日期的最大TCR转导细胞百分比：4293（42%，day6），4367（55%，day5），4378（58%，day10），4405（79%，day6），4420（84%，day15），4469（62%，day5）和4484（58%，day11）。通过非配对t检验，比较反应者（4378、4405和4420）与无反应者（4293、4367、4369和4484）之间的Cmax值，得到P=0.07。因此，没有观察到持久性或T细胞扩增峰值与治疗反应之间有明显的关联。

还分析了转移后PBL中持续表达TCR细胞的表型。观察到了显著的患者间差异，但没有发现与临床反应相关的参数。

在患者4378中，通过检测转移后PBMC样本对肽脉冲自体DC的IFNγ分泌来评估持久性TCR转导细胞的功能。测试的样本中，如果检测到TCR转导的细胞，与野生型肽相比这些PBL会特异性地针对相关突变肽分泌IFNγ。

最后，在治疗后大约1周和1个月时，对患者收集的PBMCs中的CD4+FoxP3+细胞比例进行了测定。虽然在每位患者的样本中都检测到了少量的调节性T细胞，但这些T细胞水平与临床反应之间没有明显的相关性。

图4 TCR转导PBL细胞的持久性。

输注后血清的探索性分析

针对每一位患者，在治疗后的不同时间点采集了血清，并检测了IFNγ和IL-2的水平（图S11）。IL-2的水平似乎与患者在治疗中接受的IL-2剂量数量相当。4378、4405、4469和4484患者在接受治疗后1天或2天采集的血清中，IFNγ的水平超过了250pg/ml，但这似乎与临床反应或毒性并不相关。

图S11 测定治疗后血清样本中的细胞因子(IFNγ和IL2)

由于这里的新抗原反应性TCR含有鼠源恒定区，探究了在治疗后这些是否会诱导人体产生抗鼠源性TCR抗体（图S12）。发现1位患者(4293)对治疗无反应应，并且发展出了抗TCR抗体反应，而在治疗后第141天之前的血清样本中并未明显检测到抗TCR的IgG抗体。

图S12 患者4293血清中抗TCR抗体的动态观察

使用逆转录病毒转导的新抗原反应性TCR-PBLs对患者进行二线ACT治疗

在本文报道的新抗原TCR临床试验的发展过程中，用TCR转导的PBL治疗了6名患者，这些患者之前在另一项试验(NCT01174121)中用过继转移的TIL治疗过。此外，治疗了第7名患者，该患者之前接受了过继转移的PBL经逆转录病毒转导表达在NCT03745326试验中通过接种HLA-A11转基因小鼠产生的鼠KRAS(G12D)反应性TCR。所有这些患者在第一次化疗前至少接受了两种不同的化疗方案。这些患者中都对他们的初级T细胞治疗没有反应，然后被转移到用个体化的新抗原反应性TCR转导的PBL进行的第二次治疗。这些患者中都对他们的TCR治疗没有反应，这可能与许多相同的新抗原被先前的治疗无效靶向的事实有关。对于所有这些患者，分析了他们的TCR输注产品、治疗前和治疗后的PBL以及治疗后的血清，就像对7名首次接受T细胞治疗的患者所做的那样。

对于这些患者，使用TCR转导的PBL进行再次治疗的理由是，可能能为他们提供含有更多新抗原反应性T细胞、且分化程度较低的产品。对比了每位患者2种T细胞产品中反应性细胞的百分比（表7）。在这7位患者中有6位（除4275患者外），估计第二次治疗产品的新生抗原反应性T细胞数量比第一次治疗中针对相同新抗原的反应性细胞多10-100倍（表7）。也根据CD39和CD69的表达评估了T细胞表型。在检测到的3位患者的大规模TIL产品中，所有T细胞中只有1.6%至3.2%具有分化程度较低的CD39-CD69-表型。相比之下，7种TCR转导细胞产品中，这些百分比范围约为实际新抗原反应性T细胞的12%至39%。接受TCR-T细胞治疗的患者获得了更多能够发展出TCR的针对相同新抗原的细胞，而这些细胞的分化程度低于常规观察到的TIL培养中的细胞。

表7 接受两次ACT治疗的患者T细胞产物的比较

因为有迹象表明来源于新抗原反应性CD8+ T细胞的TCRs可能在治疗上是有益的，在来自4名接受CD8衍生TCRs的患者的输注产品中的T细胞上进行单细胞RNA-seq：4378和4420，他们是T细胞治疗的初次患者并且对治疗有反应，以及4275和4317，他们先前已经用TILs治疗。对表达新抗原反应性TCR的单个T细胞进行FACS分选，对TCR工程化T细胞进行无监督转录组聚类，然后进行UMAP分析，确定了输注产品中的CD8+和CD4+ TCR工程化T细胞。输注产品中CD8+TCR+ T细胞的亚群和特异性分析显示，没有单一细胞状态可将对治疗有反应的患者细胞(4378和4420)与对治疗无反应的患者细胞(4275和4317)。与FACS染色一致，大多数细胞以效应记忆细胞状态存在。

总结

通过逆转录病毒转导基因改造的T淋巴细胞表达个性化的新抗原反应性TCR，可以在某些对常规疗法无效的转移性结直肠癌患者中被耐受并介导肿瘤消退。治疗了7名之前未接受过T细胞疗法的患者，其中3名患者根据RECIST标准达到了部分缓解的临床反应。我们认为报告这些早期发现很重要，因为这里描述的患者反应证明了针对随机体细胞突变的个性化TCR策略可能导致肿瘤消退这一原理，这是以前从未报告过的观察结果。

在先前的一项临床研究（NCT03970382）中，16名患有不同类型难治性实体瘤的患者接受了自体PBLs治疗。这些细胞通过非病毒精确基因编辑方法改造，以表达个性化的新抗原反应性TCRs。未观察到客观的临床反应。该研究作为剂量递增试验进行，给予患者的表达新抗原反应性TCR的T细胞数量范围从2.0×10^8到5.4×10^9，中位数为1.3×10^9输注的neoTCR+细胞。相比之下，这里施用的新抗原反应性TCR转导细胞范围从1.8×10^10到1.0×10^11，中位数为7.8×10^10 neoTCR+细胞。此外，他们只对16名患者中的4名给予了低剂量皮下IL-2，而该试验中除1名患者外，所有患者都至少接受了一次高剂量静脉IL-2。这些差异可能部分解释了我们在试验中观察到的增强疗效。

评估了治疗前PBLs的表型，转移后细胞的功能和表型，以及治疗后患者循环中转移细胞的持久性，但没有发现与临床反应的明显关联。尽管如此，这项研究可能为改进疗法提供一些见解。目前正在探索加速TCR鉴定过程的方法。通过新鲜肿瘤消化物的T细胞转录组基因特征以及通过流式细胞术分选新鲜切除肿瘤中的CD8+、PD-1+、CD39+和TIGIT+ T细胞，可以识别出针对新抗原反应的TCR。这两种方法都避免了在筛选前从TIL片段中扩增T细胞的需要。此外，之前已经通过PBLs的转录组基因特征以及通过使用新抗原肽和HLA tetramer对PBLs进行分选来鉴定新抗原反应的TCR。如果拥有原发性肿瘤活检的测序数据，可能无需额外的肿瘤切除，就能对PBLs进行筛查并识别新抗原TCR。

接受HLA I限制性CD8+ T细胞来源TCR的两位患者都显示出客观的临床疗效。之前发现，来自胃肠道癌症患者TILs的新抗原反应性中，只有大约一半是受HLA I限制的。然而，通过使用新鲜肿瘤消化物和外周血的基因特征，以及从这两来源通过FACS分选特定细胞，我们已经能够鉴定出常规筛选方法未发现的CD8反应性TCR。也已经通过从外周血和肿瘤来源的T细胞进行新抗原特异性体外刺激，筛选出新的CD8衍生TCR。目前，正在利用所有这些方法来为常见上皮癌患者寻找更多的CD8衍生TCR。

小鼠和人类的多项研究表明，分化程度较低的肿瘤特异性T淋巴细胞与临床结果呈正相关。这里生产大量新抗原反应性T细胞的方案涉及两次强烈的CD3刺激，这些刺激诱导细胞增殖和分化。在第二次刺激前和后立即评估了TCR转导细胞的表型，不出所料，观察到在第二次刺激后细胞分化程度更高。此外，TCR转导细胞的整体百分比有统计学意义的下降。因此，目前正致力于开发无需进行第二次CD3刺激就能扩增TCR转导细胞的方法。

在先前一项针对恶性黑色素瘤患者的临床研究中，接受过适应性转移TILs治疗的患者，其CD39-CD69-双阴性细胞的数量和百分比与治疗响应呈正相关。有趣的是，2名未接受过T细胞治疗的患者接受了CD8衍生TCR转移，他们显示出客观的临床反应，并且体内含有最高比例的CD39-CD69-双阴性细胞（或仅以CD39-为单一标记的细胞）。综合这些观察结果，可以推测在治疗前对这些双阴性细胞进行分选或选择性转导可能是有益的。

肿瘤细胞异质性和HLA等位基因丢失对开发针对新抗原的TCR疗法构成了两大严峻挑战。在当前研究中，这里靶向的5个新抗原是亚克隆性的，且在一个患者切除的肿瘤中发现了HLA等位基因丢失（表2）。此外，之前已经确定了接受新抗原反应性T细胞治疗的患者，他们的复发肿瘤存在HLA等位基因丢失，导致靶向目标新抗原的MHC限制性元素特异性丧失。由于生产个体GMP标准逆转录病毒和T细胞产品的复杂物流，目前限制每位患者的治疗限制在单一产品最多5个独立TCR的产品，至今为止，只治疗了最多2个TCR的患者。为了应对肿瘤细胞异质性和HLA等位基因丢失，我们认为用多种新抗原反应性TCR治疗患者至关重要。为此，目前正在利用基因特征和体外刺激PBLs和TILs，以及标准TIL筛选方法，尽可能地为每位患者鉴定TCR。最后，正在开发简化逆转录病毒和细胞制造流程，这将使其能够在最终的TCR输注产品中靶向多达10个新抗原，从而使这种治疗更具实践性，并有可能克服肿瘤异质性和免疫抵抗性。

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Foy, S. P. et al. Non-viral precision T cell receptor replacement for personalized cell therapy. Nature 615, 687-696 (2023).

Yossef, R. et al. Phenotypic signatures of circulating neoantigen-reactive CD8+ T cells in patients with metastatic cancers. Cancer Cell 41, 2154-2165.e5 (2023).

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