乳腺癌ESR1在外源肽脉冲和内源性抗原处理后TCR识别不一致

为了扩大TCR-T疗法以治疗更多癌症类型的患者，需要识别肿瘤特异性抗原靶点的新TCRs。AKT1、ESR1、PIK3CA和TP53的驱动突变在转移性乳腺癌(MBC)患者中很常见，免疫原性可以作为TCR-T治疗该疾病的理想肿瘤特异性靶点。通过IFN-γ ELISpot对体外扩增的新肽刺激的T细胞株进行筛选，鉴定了13个突变中的11个具有反应性。这里鉴定了一个ESR1 Y537S特异性T细胞克隆，克隆16，和一个ESR1 Y537S/D538G双特异性T细胞克隆，克隆21，这两个克隆分别是HLA-B*40:02和HLA-C*01:02限制的。表达这些TCR的TCR-T识别和杀伤ESR1新肽脉冲的靶细胞，对ESR1 WT肽的活性最低。然而，这些TCR不能识别表达内源性突变ESR1的靶细胞。为了研究这种缺乏识别的基础，对一个突变的过表达的淋巴母细胞系进行了免疫肽组学分析，发现ESR1 Y537S新肽在外源性脉冲靶细胞时，尽管与HLA-B*40:02结合，但没有内源性处理。这些结果表明，用脉冲最小肽刺激可能来自幼稚的T细胞可能会导致识别未加工多肽的克隆的扩增，并突显出采用能够选择性地扩增那些对能有效加工和展示抗原具有特异性的T细胞的方法的重要性。

为了将TCR-T治疗的益处扩展到更多不同癌症亚型的患者，迫切需要寻找新的TCRs来靶向肿瘤选择性表达的抗原，以诱导强大而安全的抗肿瘤作用。新抗原是由仅存在于恶性细胞中的体细胞突变产生的，代表了这种癌症限制的靶点。被称为“驱动突变”的一个相对较小的突变子集已被证明可以直接增强细胞适应性和肿瘤发生，因此更有可能在转移性肿瘤中均匀表达，并在特定癌症亚型的患者中共享。因此，由常见驱动基因突变产生的新抗原可能为安全有效的TCR-T治疗提供靶抗原。然而，到目前为止，人们发现能够识别在299个已注释驱动基因中的突变的TCRs数量并不多【Comprehensive Characterization of Cancer Driver Genes and Mutations】。

乳腺癌(BC)是全世界女性癌症病例和癌症死亡人数最多的疾病。尽管转移性乳腺癌(MBC)的治疗取得了显著进展，延长了患者的生存期，但MBC仍被认为是一种不治之症。因此，迫切需要为MBC患者提供新的治疗方案。在MBC中，AKT1、ESR1、PIK3CA和TP53的错义驱动突变很常见，如果具有免疫原性，可以作为MBC TCR-T治疗的靶点。在这项研究中，我们试图发现对这些常见的MBC突变具有特异性的TCR，用于MBC的TCR-T治疗。

许多TCR发现工作的早期关键步骤是选择性地扩增和富集具有所需抗原特异性的T细胞。这通常是通过用目的抗原刺激T细胞来实现的，以自体肿瘤组织的形式、DC编辑以表达目的抗原、或者通常用DC外源负载目的肽。然而，这些刺激方法对已识别的TCR的功能结果的影响尚未得到广泛报道。

在这里，从健康供者和激素受体阳性的MBC(HR+MBC)患者的外周血中扩增T细胞，方法是用负载了AKT1、ESR1、PIK3CA和TP53的13个常见错义突变的新肽的DC进行刺激。对扩增系的ELISPOT分析显示，T细胞成功地扩增出了针对13个目标突变中10个的新肽特异性T细胞。进一步分离和克隆了2个ESR1 Y537S特异的TCR(HLA-B*40:01限制性)或ESR1 Y537S和D538G的双特异性TCR(HLA-C*01:02限制性)。然而，虽然这些TCRs介导选择性和高效地杀伤ESR1新肽负载的靶细胞，但它们无法识别表达其同源ESR1突变的靶细胞。通过免疫肽组学分析，确定了ESR1 Y537S新肽与突变表达靶点TCR识别差异的原因是由于缺乏对同源ESR1 Y537S新肽的内源性加工，尽管该肽能够与HLA结合并在外源性负载时引发强大的T细胞反应。

这里结果显示了使用多肽作为选择性扩增T细胞来发现TCR的潜在后果，并强调了在识别抗原靶点和选择合适的TCR发现方法时预先考虑抗原处理的重要性。

常见MBC突变新肽特异性T细胞的扩增

为了确定是否能够对来自常见MBC驱动基因突变的新肽产生T细胞反应，生成了一个重叠的15-mer肽文库，覆盖了AKT1、ESR1、PIK3CA和TP53(图1A)中的13个错义突变，称为MBCneo-pepmix。使用成熟的方案从外周血中扩增抗原特异性T细胞。简言之，从健康供者和肿瘤至少表达一种目标突变的HR+MBC患者中分离出PBMC，然后生成了单核细胞来源的DC，并用MBCneo-pepmix脉冲的DC进行2-3轮T细胞刺激；所得到的扩增的T细胞称为MBCneo-CTL(图1B)。为了确定MBCneo-CTL识别哪些刺激肽，刺激MBCneo-pepmix的每个单独肽进行IFN-γ ELISpot测定。观察到在14个健康供者来源的品系中有8个(57%)和11个HR+MBC患者来源的品系中有7个(64%)针对至少一个新肽的T细胞反应(图1C)。对于每个由MBCneo-CTL株引起反应的新肽，测试了该株对相应的WT肽的反应。在大多数情况下，MBCneo-CTL株对相应的WT肽显示出极小的或没有反应，但也确实观察到MBCneo-CTL未能从相应的WT肽中区分出新肽的几个例子(图S1)。虽然7个HR+MBC患者来源品系中观察到了新肽的反应性，但出乎意料的是，这些反应都不是针对在患者自身肿瘤中检测到的突变(图1C)。这些结果表明，许多共享的MBC新肽可以被T细胞识别。

图1 健康供者和MBC患者外周血中MBC新抗原特异性T细胞的扩增。

图S1 MBCneo-CTL细胞株对MBC新肽和相应WT肽的特异性

识别ESR1热点突变的TCRs的分离

供体1 MBCneo-CTL系对来自ESR1 Y537S (NVVPLSDLLLEMLDA)和D538G (NVVPLYGLLLEMLDA)的2个15-mer新肽具有高度特异性，与相应的ESR1 WT肽(NVVPLYDLLLEMLDA)反应最小(图1C和图2A)。为了确定这种新肽反应是由CD8还是CD4 T细胞介导的，用ESR1 Y537S或D538G新肽或不相关的多肽刺激后进行了细胞内细胞因子染色。观察到在ESR1 Y537S或D538G刺激的CD8+T细胞中IFN-γ和TNF-α的产生增加，但不是无关肽，表明HLA I类限制了TCR的识别(图2B)。为了确定供体1 MBCneo-CTL的细胞毒作用，用ESR1 WT、Y537S和D538G三种肽脉冲自体植物血凝素-L(PHA)刺激的T细胞(PHA blasts)，然后进行了Cr-51释放的细胞毒实验。供体1 MBCneo-CTL系对ESR1 Y537S或D538G新肽脉冲的PHA blasts 在40:1的E:T比下的细胞毒性分别为64.8%和55.8%，对ESR1 WT脉冲靶标具有最小的杀伤(13.4%的特异性裂解)(图2C)。

图2 ESR1突变特异性TCRs的分离和鉴定。

供体1 MBCneo-CTL株对ESR1 Y537S和D538G肽脉冲靶标具有高度特异性和HLA I类限制性识别和杀伤作用，从该株系中分离反应性TCRs。使用基于单细胞RNA测序(scRNAseq)的TCR发现方法，用ESR1 WT、Y537S或D538G肽刺激供体1 MBCneo-CTL 12h，之后用寡核苷酸标记的抗体(Cell Hashing)对每种条件下的细胞进行染色，使能够在执行scRNAseq之前合并这三个条件(图2D)。然后，鉴定了在ESR1 Y537S或D538G多肽刺激下上调IFN-γ和/或TNF-α的克隆型。克隆16是对ESR1 Y537S刺激反应的最高IFN-γ表达克隆，克隆21是对ESR1 Y537S或D538G刺激反应上调IFN-γ的克隆(图2E)。

获得了克隆16和21的全长TCRα/β序列，然后将这些TCR组装成逆转录病毒载体(图2F)。为了防止TCR错配，在转基因TCRα/β恒定区中引入了三种修饰，即：①用小鼠TCR恒定区取代人恒定区；②α/β恒定区中的单点突变以促进额外的二硫键；以及③TCRα恒定区跨膜区的三个疏水取代(LSVMGLRIL→LLVIVLRIL)。转导CD3和CD28抗体激活的T细胞(OKT3 blasts)，观察到克隆16和21 TCR的转导效率＞90%(图2g-h)。与scRNAseq结果一致，与克隆16TCR转导的T细胞对ESR1 Y537S肽具有高反应(图2I)。通过测试克隆16TCR-T对ESR1 Y537S新肽浓度梯度的反应，还观察到该TCR-T对低至1.093 nm的肽(110 IFN-γ SFU)具有高的抗原敏感性(图2J)。转导克隆21 TCR的T细胞最初对ESR1 Y537S和D538G肽的反应最小，但对WT肽不起作用(分别为46、258和4 SFU)。然而，用ESR1 Y537S肽脉冲的自体DC刺激克隆21TCR-T后，通过ELISpot分析(图2K)，TCR-T显示出对ESR1 Y537S和D538G而不是WT肽的双重特异性，以及通过Cr-51释放细胞毒性试验(图2L)特异性地杀伤由ESR1 Y537S和D538G脉冲的自体PHA blasts的能力(分别为31.3%、77.8%和9.1%)。

为了确定TCRs对HLA的限制性，将供体1 PBMC中的6个HLA I类等位基因分别克隆到带有截短CD19(tCD19)报告基因的逆转录病毒载体中。用每个候选等位基因转导完全HLA I类不相合的同种异体OKT3 blasts，然后在共培养的IFN-γ ELISpot试验或Cr-51释放细胞毒性试验中评价TCR-T对脉冲同源ESR1新肽的靶细胞的反应。克隆16 TCR-T仅在表达HLA-B*40:02的靶细胞呈现时才对ESR1 Y537S新肽起反应(图2M)，而克隆21 TCR-T仅在靶细胞转导HLA-C*01:02时才对ESR1 Y537S和D538G新肽脉冲的靶细胞起反应(图2N)。为了确定克隆16和21 TCR-T识别的最小ESR1 Y537S表位，测试了它们对ESR1 Y537S 15mer (NVVPLSDLLLEMLDA) 8-10mer组分的反应。对于克隆16 TCR-T，观察到对10mer肽(PLSDLLLEML)的最大反应(图2O)，而克隆21 TCR-T对10mer肽(NVVPLSDLLL)的反应最大(图2P)。

克隆16和21 TCR-T不能识别表达ESR1突变的靶细胞

为了确定克隆16 TCR-T是否能够识别表达全长ESR1 Y537S突变蛋白的靶细胞，使HLA-B*40:02表达的EBV转化的淋巴母细胞系(LCL)转导了全长ESR1 Y537S，并且使293T细胞与HLA-B*40:02和全长ESR1 Y537S共同转导。293T和LCL分别以表达标准蛋白酶体和免疫蛋白酶体为主。通过荧光激活细胞分选(FACs)检测截短的CD34报告基因(Q8)来选择表达全长ESR1 Y537S或模拟载体的细胞，并用Western Blot证实ESR1编码的蛋白质ERα过表达。然后，将这些细胞与克隆16 TCR-T共培养，并用ELISpot检测抗原识别能力。与模拟载体转导的靶标相比，观察到克隆16 TCR-T对ESR1 Y537S肽负载的LCL和293T靶标有较强的反应，但对未脉冲的ESR1 Y537S过表达靶标没有反应(图3A)。为了评价克隆16 TCR-T能否长期识别ESR1 Y537S高表达靶点，将TCR-T与靶细胞共同培养72h，然后用流式细胞仪检测靶细胞杀伤和TCR-T激活。尽管观察到，当与克隆16 TCR-T培养时，4-1BB上调了T细胞的激活，并且几乎完全清除了载肽的LCL和293T靶细胞，但与高表达LCL和293T的非脉冲ESR1 Y537S培养后，4-1BB没有杀伤或上调(图3B-C)。在评估克隆21 TCR-T识别肽脉冲或表达全长ESR1 D538G突变的靶点的能力时，观察到了可比的结果。这包括靶向编辑的LCL和293T，以及被CRISPR编辑为内源性表达ESR1 D538G突变HR+BC细胞系MCF7(图S4)。

图3 克隆16 TCR对ESR1 Y537S表达靶点的反应。

图S4 克隆21 TCR对表达HLA-C*01:02和ESR1 D538G突变的细胞株的抗肿瘤作用

ESR1 Y537S内源性抗原加工特性的研究

假设，克隆16和21 TCR-T对ESR1新肽负载的靶标和ESR1突变表达靶标的反应差异是同源ESR1新肽的内源加工效率低下的结果。为了验证这一假设，对转导的表达HLA-B*40:02的LCL进行了免疫肽组学分析，并根据全长ESR1 Y537S(LCL-Y537S)或模拟载体(LCL-Empty)的表达对FAC进行了分类。作为阳性对照，还分析了预先加载同源ESR1 Y537S 10mer肽(PLSDLLLEML) (LCL-Y537S-肽)的LCL-Y537S细胞。为了证实ESR1 Y537S在LCL-Y537S细胞中的过表达和用质谱仪(MS)检测ESR1肽的能力，对HLA I类pull-down后的阴性部分进行了ERα免疫沉淀MS(IP-MS)。在LCL-Y537S细胞的Erα IP-MS中，检测到24个独特的ERα肽，它们总共覆盖了ERα序列的45.04%(图4A)，其中重要的包括一个含有ESR1 Y537S突变的肽(NVVPLSDLLLEMLDAHR)(图4B)。这证实了在这些LCL中ESR1 Y537S的过表达，并且通过MS能够检测到该突变。HLA I类分子洗脱下来的肽段进行了串联质谱标签(TMT)标记以进行定量分析。在三种条件下(LCL-Empty、LCL-Y537S和LCL-Y537S-肽)，共检测到10个HLA I类洗脱的ERα多肽，其中8个可通过TMT标记定量。在TMT定量的8个ERα肽中，有6个位于Erα WT区(ERα319-507)，并且在LCL-Y537S和LCL-Y537S-肽条件下均检测到高于LCL-Empty的报告离子强度。检测到两个含有ESR1 Y537S突变的TMT定量ERα肽：10mer(PLSDLLLEML)和相关的8mer(SDLLLEML)。关键的是，这两个ESR1 Y537S突变肽只在用ESR1 Y537S新肽(LCL-Y537S-肽)脉冲的LCL中检测到，而在未脉冲的LCL-Y537S条件下(图4C)，这两个ESR1 Y537S突变肽的报告离子强度高于LCL-Empty (图4C)。总体而言，这一数据表明，部分WT ERα肽在ERα319-507区内存在内源性加工和HLA I类呈递，而突变的Y537S肽缺乏内源性加工，尽管当外源脉冲作为最小肽时，它与HLA-B*40:02结合。

图4 ESR1 Y537S内源性处理和呈递的免疫肽组学分析。

总结

这里从一个健康供体来源的MBCneo-CTL系中分离到两个针对ESR1热点突变的TCR。利用TCRs获得了很高的转导效率，这使得TCR-T能够有效和选择性地识别和杀伤ESR1新肽脉冲靶细胞。然而，通过几个体外模型证明，这些TCR不能识别表达内源性ESR1突变的靶细胞。通过对ESR1 Y537S高表达LCL的免疫肽组学分析解释了这种差异，发现在蛋白质的WT区有几个内源性加工和呈递的ERα肽，但证实了同源ESR1 Y537S肽没有加工。

从健康供者的外周血中扩增新肽特异性T细胞的能力是值得注意的。由于这些MBC驱动突变在健康组织中不存在，健康供体来源的新肽特异性T细胞很可能来自幼稚的T细胞库。这些发现与其他关于来自健康供者的新抗原特异性T细胞扩增的报道一致。从HR+MBC患者中获得了至少表达一个靶基因突变的MBCneo-CTL株，包括ESR1 Y537S(3例)、ESR1 D538G(3例)、PIK3CA E545K(1例)、PIK3CA H1047L(1例)、PIK3CA H1047R(5例)和TP53 R175H(1例)。虽然能够从11名HR+MBC患者中的7名(64%)的外周血中扩增出新肽特异性T细胞，但惊讶地发现，这些患者的MBCneo-CTL株对其肿瘤中检测到的突变没有反应。因此，从HR+MBC患者体内扩增的新多肽特异性T细胞很可能来源于幼稚T细胞库。这是令人惊讶的，因为原本预计患者会对他们的癌症表达的驱动程序突变产生免疫力，在这种情况下，将扩增这些新肽的特异性记忆T细胞。事实上，最近的几篇报道已经描述了从癌症患者的外周血T细胞中识别和/或扩增新抗原特异性T细胞。最终，观察到至少一个MBCneo-CTL株对所筛选的13个MBC驱动突变中的11个具有T细胞反应性，其中先前的报道描述了T细胞对AKT1 E17K、PIK3CA H1047L、TP53 R248Q和TP53 R248W的反应。这里首次报道来自ESR1 Y537S、ESR1 D538G、PIK3CA E542K、PIK3CA E545K、PIK3CA H1047R和TP53 R273H的T细胞对新肽的反应。然而，重要的是要注意到，在IFN-γ ELISpot筛选中观察到的T细胞对脉冲15mer新肽的反应性，因此没有评估这些新肽被内源性处理的能力。

推测克隆21这种HLA-C*01:02限制性TCR的独特双重特异性源于ESR1 Y537S和ESR1 D538G肽之间的高度序列相似性。这一发现类似于最近一份TCR的报告【Systematic discovery and validation of T cell targets directed against oncogenic KRAS mutations】，该报告既识别KRAS G12V和G12C突变，又不识别相应的KRAS WT序列。双靶向TCR可用于扩大可能从单一TCR-T产品中受益的患者数量。

两个新抗原特异性TCR：ESR1 Y537S特异性/HLA-B*40:02限制性；ESR1 Y537S/D538G特异性/HLA-C*01:02限制性。用这些TCR中的每一个设计的TCR-T选择性和有效地识别和杀死脉冲了同源新肽的靶标。然而，没有观察到这些新肽特异性TCR对表达靶突变的靶细胞的反应，无论是内源性的还是通过过度表达的。因此，这些TCR似乎识别未经内源性处理的新肽。这一结论得到了转导过表达全长ESR1 Y537S的LCL免疫肽组学研究的支持。在此，在ERα319-507区鉴定了6个HLA I类呈递的Erα WT肽。关键的是，虽然从ESR1 Y537S肽脉冲的LCL中检测到了HLA I类结合的ESR1 Y537S肽(PLSDLLLEML和SDLLLEML)，但在没有肽脉冲的LCL中没有检测到这些新肽。这些数据表明，ESR1 Y537S新肽不是由主要表达免疫蛋白酶体的细胞内源性加工的，至少在该LCL株表达的HLA I类等位基因(HLA-A*02:01、-A*01:01、-B*40:02、-B*08:01、-C*15:02和-C*07:01)的背景下是这样的。总之，数据表明，虽然ESR1 Y537S和D538G新肽能够与HLA分子结合并激发强大的T细胞反应，但这些肽没有被内源性加工，最终使它们在生理相关意义上是非免疫原性的。这些发现可能支持癌症免疫编辑假说，该假说假设，由于免疫压力导致充分免疫原性的癌细胞被消除，免疫原性较低的细胞会产生。事实上，最近在患者中的几项研究表明，免疫压力会导致肿瘤细胞的出现，这些肿瘤细胞表达的高质量新抗原比预期的要少。因此，这里观察到的ESR1 Y537S和D538G突变缺乏免疫原性，可能为了解这些突变高发的机制提供新的见解。

基于这里的数据，提出一个框架，用于考虑用于选择新抗原特异性T细胞的策略将如何影响分离的TCR识别内源性处理的新肽(真正的新抗原)与非内源性处理的新肽(未处理的新肽)的可能性。观察到的针对未加工新肽的特异性T细胞克隆的扩增可能是由于MBCneo-CTL制造过程的特定方面的结果，在该过程中，最有可能来自幼稚库的T细胞被最小肽刺激，这些肽可以绕过HLA I类抗原处理途径中的步骤。虽然类似的方法导致了识别真正新抗原的TCRs的鉴定，但这种方法也产生了针对未加工新肽的TCRs。由于经历过抗原的T细胞已经在体内被真正的抗原启动和激活，从癌症患者的经历抗原的隔室中特异地扩增新抗原特异性T细胞的方法(例如，选择记忆或PD1+T细胞)已经报告了高比率地分离出针对真正新抗原的TCRs。当新抗原特异的T细胞从未选择的库中扩增时，识别真正新抗原的T细胞克隆可以通过用经过编辑的APC刺激它们而优先扩增，以全长或微基因转基因的形式表达新抗原，从而确保T细胞只被加工和呈递的新抗原刺激。即使使用多肽刺激方法进行选择性T细胞扩增，也可以在开发流程的早期评估对新抗原表达靶点的反应性，以便在下游TCR发现之前识别真正的新抗原反应。该发现也支持一种新兴的方法，即只用免疫肽组学数据库中首次鉴定的最小新肽来刺激T细胞，从而代表真正的新抗原。研究证明了特异性的ESR1 Y537S和D538G新肽缺乏内源性加工处理，并强调了结合预先考虑抗原加工的TCR发现方法的重要性。

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