去泛素化YOD1调节CDK1稳定性并驱动三阴性乳腺癌肿瘤发生

2024-03-27 10:26 吉满生物

YOD1可能被证明是TNBC的一个有前途的治疗靶点

研究背景

乳腺癌 是女性最常见的恶性肿瘤之一，而三阴性乳腺癌则是其中最具侵袭性和最难治疗的亚型之一。近年来的研究表明，细胞周期调节在三阴性乳腺癌的发生和发展中起着重要的作用。本研究发现，去泛素化酶YOD1参与调控细胞周期蛋白依赖激酶1(CDK1)的稳定性，进而推动三阴性乳腺癌的肿瘤发生。

文献来源

南京中医药大学科研团队在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research上发表一篇名为“Deubiquitylase YOD1 regulates CDK1 stability and drives triple-negative breast cancer tumorigenesis”的文章，描述了YOD1 在人类 TNBC 中的表达和功能，并探索其潜在的分子机制。

研究结果

首先通过乳腺癌数据 TCGA 数据库来分析与生存相关的 OTUD 家族成员之间的关系，结果显示，OTUD2(YOD1)、OTUD3、OTUD6A和OTUD6B在TNBC样本中呈负相关。通过qRT-PCR和Western blot检测了32例TNBC和44例NTNBC样本中YOD1的表达，发现与NTNBC组织相比，YOD1在TNBC组织中显着上调，同时IHC 染色检测结果分析表明，YOD1表达水平较高的患者生存结果往往较差。

Fig.1 YOD1在TNBC中显着上调，与不良预后呈负相关

为了研究YOD1在TNBC中的功能，使用慢病毒构建稳定过表达或敲低YOD1的BT-549和MDA-MB-231细胞，结果显示，YOD1敲低显著抑制了细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力，流式细胞实验进一步发现，YOD1敲低导致细胞处于S-G2期发生明显阻滞且S期减少，YOD1过表达促进TNBC细胞增殖、迁移和侵袭能力。

Fig.2 YOD1过表达促进TNBC细胞增殖、迁移和侵袭

紫杉醇和顺铂是TNBC晚期的代表性化疗药物，为了研究YOD1基因是否参与TNBC耐药性，使用10nM的顺铂和50nM的紫杉醇分别处理TNBC细胞24h后，流式细胞术和 TUNEL 实验检测细胞凋亡发现，过表达YOD1的TNBC细胞系对顺铂或紫杉醇的耐药性更强，细胞凋亡减少，而YOD1敲低则增加了对顺铂或紫杉醇的敏感性，导致细胞凋亡。

Fig.3 YOD1过度表达与乳腺癌细胞耐药相关

为了进一步了解YOD1在TNBC中的分子机制，作者使用LC-MC/MS实验鉴定与YOD1结合的潜在蛋白。结果发现，CDK1被鉴定为对YOD1具有高特异性的相互作用靶标。为了进一步评估蛋白质相互作用，使用免疫共沉淀、邻近连接 (PLA) 和双分子荧光互补 (BiFC) 分析发现，YOD1和CDK1之间存在直接相互作用。

Fig.4 YOD1与TNBC细胞中的CDK1直接相互作用

根据前人研究发现，YOD1包含三个主要结构域，为了进一步探索YOD1结构域上的CDK1结合位点，分别构建了三个YOD1截断突变质粒，与CDK1过表达质粒共转293T细胞，WB和免疫共沉淀实验证明，CDK1特异性结合YOD1的C末端Znf结构域。

Fig.5 CDK1与YOD1的C端Znf结构域结合

通过WB检测和免疫沉淀实验发现，TNBC细胞中CDK1蛋白表达水平更高，YOD1与CDK1蛋白结合，并且可以正向调节CDK1蛋白的表达水平。

接下来对各种三阴性乳腺癌(TNBC)和非三阴性乳腺癌(NTNBC)细胞系中CDK1泛素化水平进行了检测，结果显示，仅在NTNBC细胞中观察到CDK1的强泛素化，而在TNBC细胞中CDK1的泛素化水平降低，并且YOD1的过表达显著降低了CDK1的泛素化水平，敲低YOD1显著增加CDK1的泛素化水平。接下来使用不同截短型的YOD1突变质粒转染HEK293T细胞进行检测CDK1的泛素化水平，结果显示，CDK1与YOD1的锌指结构域结合，YOD1-T-OTUD是YOD1的特异性去泛素化结构域，N-末端结构域没有去泛素化作用。

此外，研究人员还在HEK293细胞中共转染了带有His标记的泛素(His-Ub)和各种YOD1截短突变体，通过共免疫沉淀实验证明OTUD是YOD1的特异性去泛素化域，结果表明OTUD和ZNF结构域对YOD1的活性都是必需的。

Fig.6 YOD1使CDK1去泛素化并维持CDK1的稳定性

为了研究YOD1在体内的作用，通过将稳定敲低YOD1基因的MDA-MB-231细胞和对照细胞移植到BALB/c裸鼠腹外侧进行实验，结果表明，与对照组相比，在YOD1敲低组中，肿瘤体积较小，生长速度较慢，肿瘤重量较轻。通过免疫荧光实验进一步评估了小鼠肿瘤组织中Ki67阳性细胞的表达和YOD1的表达水平，发现YOD1敲除肿瘤中的Ki67染色强度和细胞数量明显减少。接下来，通过免疫印迹分析了肿瘤组织中YOD1和CDK1的表达，发现YOD1敲除乳腺肿瘤小鼠的肿瘤组织中CDK1的表达水平下调。