膜融合纳米颗粒的HLA多肽寻址通用TCR-T细胞治疗实体瘤

TCR-T细胞治疗在实体瘤的基础研究和临床试验中已显示出良好的疗效，全球首款TCR-T afami-cel向FDA已完成滚动上市申报。由于多肽依赖性识别和HLA限制，TCR-T细胞治疗通常是针对单个抗原的定制设计。缺乏合适的肿瘤细胞通用靶点大大限制了其临床应用，建立通用的TCR-T治疗策略具有重要意义。这里设计并评价了基于HLA多肽(pHLA)负载膜融合递送系统的HLA多肽寻址通用(HAUL)TCR-T细胞疗法。基于pHLA-NP的肿瘤细胞膜修饰技术可以通过膜融合纳米颗粒将pHLA转移到肿瘤细胞表面。然后，肿瘤细胞被TCR-T细胞特异性地识别和杀伤。HAUL TCR-T细胞治疗技术是一项通用技术，使肿瘤细胞能够被特定的TCR-T细胞识别和杀死，而不受肿瘤细胞HLA分型的影响。这里首次提出在肿瘤细胞膜上添加pHLA作为TCR-T细胞特异性识别的靶点，不受HLA的限制，解决TCR-T细胞治疗缺乏有效靶点的问题。HAUL TCR-T细胞疗法的原理证明，该疗法在实体瘤的临床应用中具有转化潜力。

TCR-T通过转基因抗原特异性TCR分子识别肿瘤细胞表面的pHLA。HLA提呈的多肽来源于任何亚细胞位置的蛋白质，拓宽了肿瘤免疫治疗的靶谱。与CAR-T相比，TCR-T更容易穿透实体瘤。

近年来，纳米材料被广泛用于将抗原或药物或激活的免疫细胞选择性地输送到靶部位，从而降低其毒性并提高疗效。目前的抗原递送策略是将多肽负载到肿瘤细胞表面的HLA分子上。例如，将特异性抗原注射到肿瘤中，使用聚合物纳米球等载体系统地将该抗原输送到局部肿瘤进行特异性释放可以引起针对该抗原的免疫反应，使最初不在肿瘤细胞中表达的抗原能够被特异性T细胞有效识别和杀伤。研究报道优化和改进的膜融合脂质体(MFL)具有肿瘤特异性，并在肿瘤组织中广泛标记，它可以将人工靶点负载到肿瘤组织上以支持后续的靶向治疗。以MFL为递送介质的协同靶向系统可能是加载TCR-T靶标的有效方法。

在治疗实体瘤的基础研究和临床试验中，TCR-T细胞疗法已显示出独特的抗肿瘤效果。然而，肿瘤细胞上缺乏合适的pHLA靶点严重制约了TCR-T细胞治疗的临床应用。首先，TCR-T的激活依赖于呈递肿瘤抗原的HLA，HLA分型不匹配限制了TCR-T的激活。第二，肿瘤的异质性是实体瘤治疗的主要问题之一。例如，NY-ESO-1在胃癌中的表达仅为10%左右，再加上HLA的局限性，只有少数患者可以考虑现有的NY-ESO-1 TCR-T细胞疗法。最后，一些肿瘤存在HLA下调、新抗原丢失等免疫逃逸现象，导致肿瘤细胞表面缺乏T细胞识别靶点。因此，TCR-T细胞疗法的普遍应用价值具有挑战性，迫切需要覆盖范围更广、功能更强大的TCR-T细胞治疗。

这里建立一种HLA多肽寻址通用TCR-T细胞治疗策略。基于膜融合纳米颗粒(NPs)将pHLA修饰到肿瘤细胞表面。这里以HLA-A2限制性的NY-ESO-1（157-165）抗原肽为模型抗原，体外制备其pHLA分子，然后将pHLA与制备的NPs一起负载到肿瘤细胞膜上，并评价该HAUL TCR-T技术在体内外的抗肿瘤作用。

pHLA-NP的生成和特性研究

目前，TCR-T细胞治疗通常是针对单个抗原的定制设计。这里HAUL TCR-T细胞治疗技术，使肿瘤细胞能够被特定的TCR-T细胞识别和杀死，而不考虑肿瘤细胞的HLA分型(图1)。pHLA-NPs通过膜融合将pHLA修饰到肿瘤细胞膜上。肿瘤细胞膜的pHLA修饰为TCR-T细胞识别提供了特异性靶点，使TCR-T细胞能够发挥不依赖于肿瘤固有靶点特征的抗肿瘤作用(图2a,b)。

图1 HAUL TCR‐T细胞疗法示意图。

膜融合NPs的制备，使用DMPC、DSPE-PEG3400-MAL和DOTAP的摩尔比为1：1：1(质量比为2.95：1：0.78)。将脂质溶解在氯仿中，然后完全干燥。剩余的脂质膜用PBS水合，然后通过100nm的膜孔挤出。

该多肽通过柔性甘氨酸-丝氨酸(GS)接头连接到β2m的氨基末端，重链被设计为在其羧基末端编码一个6xHis标签和一个游离半胱氨酸(图2c)。在大肠杆菌BL21(图S1a)中成功表达pHLA蛋白(图2d)，经SDS-PAGE分析其分子质量约为49.4kDa(图S1b)，随后通过Ni-NTA柱进行稀释复性和纯化(图S1c,d)。将pHLA蛋白包被于乳胶微球上，用HLA-A2构象特异性单抗W6/32(PE)或HLA-02-PE进行检测。与pHLA连接的微球的荧光强度增加，表明pHLA已折叠成正确的空间构象(图2e)。透射电镜图像显示纳米颗粒近似为球形且分散良好(图2f)。透射电镜测得的粒径与DLS测得的粒径基本相同(图2f,g)。DLS测得NPs的平均粒径为113.00±0.40nm(图2g,h)，平均电荷为16.83±0.55mV(图2g-I)。DLS监测PBS溶液中NPs粒径和电荷的变化一周。尺寸和电荷波动很小，表明NPs在缓冲液中是稳定的(图2j,k)。pHLA的C-端Cys残基通过Michael加成反应提供游离巯基与DSPE-PEG-MAL的马来酰亚胺基团连接(图S1e,g)。pHLA-NPs不影响肿瘤细胞的活性(图S2a-c)。

图2 pHLA-NPs的构建和HAUL-TCR-T疗法的免疫治疗机制。

图S1 pHLA和pHLA-NP的生成。

图S2 pHLA-NPs不影响肿瘤细胞的活性。

pHLA-NP可将pHLA转移到肿瘤细胞表面

通过共聚焦显微镜观察pHLA-NP是否能够将pHLA转移到肿瘤细胞膜上。用抗His标记抗体检测pHLA分子，用Dil和DAPI对细胞膜和细胞核进行染色。共聚焦图像显示pHLA与细胞膜染料DiI共定位，表明pHLA已成功转移到肿瘤细胞膜(图3a)。肿瘤细胞系SNU719也被pHLA分子修饰。相比之下，没有或少数pHLA可以转移到非肿瘤细胞293T、NIH3T3和GES-1的膜上(图3b)。细胞表面pHLA密度可控。理论上，只需要7.4μg NPs即可与100μg pHLA完全反应。研究了NPs与NUGC4结合的剂量反应。高达100μg/mL NPs仍不能100%包覆10^6 NUGC4细胞，高达1000μg/mL pHLA-NPs仍不能100%包覆10^6 NUGC4细胞(图S1f,h)。

然后，通过瘤内注射和腹膜内注射来评价pHLA-NPs在体内的分布。用Cy5-NHS标记pHLA，将pHLA-NPs注射到荷瘤裸鼠体内。从肿瘤部位的近红外荧光信号定量图可以看出，在肿瘤部位，前24h没有明显的荧光衰减，96h后仍有一定的荧光强度(图3c,d)。用Cy5-NHS标记pHLA，并将pHLA-NPs注射到萤火虫荧光素酶(ffluc)荷瘤裸鼠体内(图3e)。结果显示， pHLA-NP在4h后已到达肿瘤部位，24h仍有一定的荧光(图3f)。在48h后进行肿瘤和其他器官的体外成像。只有肿瘤有荧光表达(图3g)。以上结果提示，pHLA-NPs修饰可通过不同途径促进与TCR-T细胞的协同作用。

图3 肿瘤膜靶向检测pHLA-NP。

HAUL TCR‐T的体外功能验证

鉴于pHLA-NPs可以有效地修饰肿瘤细胞膜上的pHLA，进一步研究了修饰后的pHLA是否可以激活相应的TCR-T细胞(图4a)。用pHLA-NP或NPs处理肿瘤细胞，并与TCR-T细胞以E:T=10:1共培养。NY-ESO-1-HLA-A*02:01 Tetramer检测到NY-ESO-1特异性TCR-T细胞的比例超过5%。负载pHLA的NUGC4组IFN-γ水平高于未修饰的NUGC4对照组。随着pHLA浓度的增加，IFN-γ水平也随之升高(p＜0.001)。此外，NUGC4对照组和NP处理的NUGC4组的IFN-γ的分泌也没有显著差异。TCR-T细胞分泌的IFN-γ增加是由于肿瘤细胞膜上负载的pHLA可以被TCR-T细胞明确识别(图4b)。与上述结果一致，负载pHLA-NP的HGC27或MKN45组的IFN-γ分泌水平显著高于HGC27或MKN45对照组(p＜0.001)(图4c,d)。用pHLA-NP或NPs修饰CFSE标记的NUGC4细胞，分别以5:1、10:1、20:1、40:1的E:T比与TCR-T细胞共培养。TCR-T细胞以E:T比率依赖的方式介导强大的T细胞杀伤作用。当E:T比为40:1时，最大杀伤率为58.3%。在相同的E:T比下，NUGC4对照组和NPs处理组的杀伤率分别为12.5%和13.5%(图4e)。肿瘤细胞的杀伤率与纳米颗粒的剂量有关。此外，T细胞活化标志物CD137的表达在pHLA负载的MKN45组显著增加(图4f,g)。

图4 pHLA-NP体外功能验证。

HAUL TCR-T抑制人胃癌细胞皮下移植模型的进展

评估交付的TCR-T细胞联合瘤内注射pHLA-NP的抗肿瘤效果。尾静脉注射NY-ESO-1特异性TCR-T细胞。12h后瘤内注射pHLA-NPs(图5a)。在肿瘤体积达到约100mm^3后的第10天和第15天进行治疗(图5b)。对照组肿瘤生长迅速，第22天肿瘤体积较治疗前增加4.76倍。HAUL TCR-T对肿瘤生长有明显抑制作用，与对照组相比，最终平均肿瘤体积减少了约58.43%(图5c-e)。CT(图5f,g)和生物发光(图S6a,b)显示，与其他组相比，HAUL TCR-T组具有显著的抗肿瘤效果。本实验表明，在皮下肿瘤模型中，pHLA-NP能修饰肿瘤细胞，并能被TCR-T细胞特异性杀伤。所有实验组的体重或重要器官组织学形态均无改变(图5h,i)，证明了TCR-T转移和瘤内注射pHLA-NP的安全性。

图5 HAUL TCR-T抑制人GC皮下移植模型的进展。裸鼠皮下接种3×10^6 ffLuc+MKN45细胞。将小鼠随机分为4组(对照组、pHLA-NP组、TCR-T组和pHLA-NP+TCR-T组)。

图S6 HAUL TCR-T抑制人GC皮下移植模型的进展。

HAUL TCR-T对人腹部播散性胃肿瘤的抑制作用

评估这种HAUL TCR-T策略治疗播散性腹部肿瘤的效果。将pHLA-NP注射到腹壁播散性胃肿瘤小鼠体内。4h后，将NY-ESO-1特异性TCR-T细胞注射到腹膜腔内(图6a)。在肿瘤植入后第10天和第15天进行治疗(图6b)。未治疗对照组的腹部肿瘤荧光信号随时间逐渐增强。结果表明，pHLA-NP单独使用对肿瘤生长无明显抑制作用。TCR-T治疗有延缓腹部肿瘤生长的趋势。HAUL TCR-T显著抑制了腹部肿瘤的生长，观察终点的相对荧光强度与对照组(p＜0.001)和TCR-T治疗组(p＜0.01)相比有统计学意义上的微弱(图6c,d)。

还研究了每组小鼠的生存期。对照组、pHLA-NP组、TCR-T组小鼠的中位生存期均在55天以内，其中HAUL TCR-T组小鼠的中位生存期延长至73天。第65天，HAUL TCR-T组80%的小鼠存活，其余各组小鼠均死亡。观察第75天，HAUL TCR-T组仍有40%的小鼠存活。以上结果证实，HAUL TCR-T治疗可产生持久而有效的抗肿瘤效果。

所有实验组均未出现肝肾功能异常(图6e,f)、体重(图6g)或重要器官组织学形态(图6i)的异常改变，这表明经腹腔注射HAUL TCR-T是安全的。

图6 HAUL TCR-T抑制人GC腹部播散性肿瘤模型的进展。

总结

在实体瘤治疗方面，虽然TCR-T细胞治疗在基础研究和临床试验中已经显示出了特异性抗肿瘤效果，但在TCR-T临床应用之前仍然面临着一些问题，特别是缺乏肿瘤特异性靶点。靶点问题主要表现在三个方面：①HLA下调导致肿瘤细胞表面缺乏T细胞识别靶点；②抗原肽错配限制了TCR-T细胞的活化；③TCR-T细胞反应性局限于HLA分子呈递的肿瘤抗原，限制了患者的类型。目前的TCR治疗依赖于HLA配型。

目前，已经尝试了几种方法来解决靶点问题，比如将特定的多肽注射到肿瘤中，或者使用高分子聚合物纳米球等载体将抗原运送到肿瘤中进行特异性释放。然而，抗原肽的递送方式有一定的局限性。一方面，患者的HLA分型必须与抗原肽相匹配，否则不能实现抗原的有效递送，从而显著降低这种抗原修饰的普遍性。另一方面，当肿瘤HLA下调或缺失时，抗原肽不能被有效地提呈到肿瘤细胞表面，从而大大降低了该方法的修饰效率。因此，这里设想是否可以将pHLA分子负载到肿瘤细胞膜上，从而克服了HLA配型的局限性，并且不受HLA表达水平的影响。使用HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原肽SLLMWITQC(157-165)作为模型抗原，在TCR-T临床试验中显示出患者的高ORRs，并且对正常组织没有毒性。

协同靶向系统可以将人工靶点加载到肿瘤组织上，以支持后续的靶向治疗。该系统首先将表面修饰的目标微球作为分子靶点输送到肿瘤部位。然后，它会注射可以与微球上的靶分子结合的药物，这样药物就可以特异性地靶向肿瘤部位，发挥杀瘤作用。有报道优化和改进的MFL是肿瘤特异性的，并在肿瘤组织中广泛标记。以MFL为递送介质的协同靶向系统是加载TCR-T靶点的有效方法。在MFL的基础上优化组成比例，并将其制成纳米颗粒，即膜融合纳米颗粒。癌细胞通过质膜分泌许多乳酸阴离子作为标志，这一特征可能导致癌细胞表面产生独特的负电荷。如果没有升高的糖酵解，正常细胞的表面保持电荷中性或略为正电。因此，肿瘤细胞可能与含有阳离子脂质DOTAP的NPs更好地相互作用，并增加融合的可能性。

此外，据报道，全身注射表面修饰的pMHC微球后，小鼠体内抗原特异性Treg细胞被激活和扩增，从而减轻了自身免疫性疾病的症状。这一结果表明，体外人工制备的pMHC可作为体内抗原特异性T细胞的识别靶点。

因此，这里通过将人工pHLA负载到肿瘤细胞表面来解决TCR-T细胞治疗缺乏合适靶点的问题。为了得到稳定的pMHC复合物单体，简化生产工艺，提高折叠效率，研究报道建立了单链三聚体(SCT)技术。多肽始终处于共价结合状态，并能牢固地结合在抗原沟槽中。即使在解离后也很容易重组，显著增加了稳态肽的占有率。在这里也设计了pHLA的SCT，通过稀释和复性成功地获得pHLA，并制备了改进的NPs。成功地制备了pHLA-NP。共聚焦结果显示，pHLA-NP可以靶向肿瘤细胞，并将pHLA转移到肿瘤细胞膜上。这是首次尝试将pHLA修饰到肿瘤细胞膜上，为TCR-T细胞治疗增加了一个特定的靶点。

体内外实验表明，pHLA-NP可以修饰肿瘤细胞膜上的pHLA，并能被TCR-T细胞特异性杀伤，从而提高抗肿瘤效果。由于遗传的不稳定性，一些肿瘤细胞可以在选择性压力下进行免疫编辑，以减少抗原的内源性呈递。部分肿瘤存在免疫逃逸现象，如HLA下调和新抗原丢失，导致肿瘤细胞表面缺乏T细胞识别靶点。在体外激活和杀伤实验中，仍观察到pHLA-NP修饰的肿瘤细胞能够被TCR-T细胞特异性识别和杀伤。这种HAUL TCR-T细胞治疗技术使肿瘤细胞能够被特定的TCR-T细胞识别和杀死，而不受肿瘤细胞的HLA分型的影响。皮下和腹部播散性肿瘤模型小鼠重要脏器和体重均无明显病理变化。在腹部播散性肿瘤模型中，各实验组均未出现肝肾功能异常改变，证实了pHLA-NP和TCR-T细胞治疗的体内安全性。

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