细胞内一氧化氮递送增强间充质干细胞治疗心肌梗死的疗效

间充质干细胞（MSCs）是具有高自我更新能力和多向分化潜力的多能干细胞。它们广泛分布在全身，具有多种用途，包括组织再生、免疫调节和血管生成。然而，干细胞治疗的一个重要挑战是移植后干细胞的低存活率，这与细胞的非特异性归巢和损伤部位的缺血/缺氧有关。此外，移植的干细胞在病理环境中不能充分发挥旁分泌作用，严重限制了干细胞的临床应用。

MSCs的促血管生成功能是治疗缺血性疾病的关键因素。通常，MSCs可以通过分泌细胞因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGFβ）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），刺激缺血组织中的局部血管生成，诱导内皮细胞形成管状结构。此外，MSCs可以募集周细胞和平滑肌细胞来促进新生血管形成。最近，据报道，MSCs通过直接分化为内皮细胞或平滑肌细胞参与血管的构建。

一氧化氮（NO）作为一种重要的信号分子，通过抑制血栓形成和促进血管生成，在维持血管稳态中发挥着至关重要的作用。最近，由于NO的多种生物功能，它对干细胞的调节越来越受到关注。NO可以通过调节细胞周期蛋白和有丝分裂受体的活性及其下游途径来调节干细胞的增殖。另一方面，NO可以调节血管生成细胞因子和免疫调节因子的表达，以提高干细胞的旁分泌性能。此外，最近的研究表明，NO可以通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT、鸟苷3′，5′-单磷酸（cGMP）和其他信号通路调节干细胞的分化行为。

因此，释放NO的生物材料已被用作干细胞的递送载体，以提高其存活率并调节旁分泌功能。然而，NO是一种气体分子，很容易扩散，并且具有很高的不稳定性。此外，NO的生理功能是剂量依赖性的，过量的NO通常会导致显著的细胞毒性。因此，应考虑优化NO的有益作用，通过调节其释放特性来增强干细胞的治疗效果。

近日，南开大学生命科学学院、生物活性材料教育部重点实验室、药物化学生物学国家重点实验室团队在国际知名期刊Science Advances上发表题为“Intracellular delivery of nitric oxide enhances the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cells for myocardial infarction”的研究综述。

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本综述基于“凹凸”的化学生物学原理，团队设计并制备了一种酶前药递送系统，并在两种不同的缺血性疾病模型中实现了NO在病变部位的靶向递送。在此，通过基因转染进一步修饰MSCs以表达催化酶（A4-β-GalH363A）。使用可注射透明质酸（HA）水凝胶作为载体移植工程化MSCs（eMSCs），同时通过尾静脉注射NO前药，以实现eMSCs中酶催化的NO的受控释放。在小鼠和大鼠心肌梗死（MI）模型中评估了骨髓间充质干细胞联合外源性NO递送的治疗效果，重点比较了两种不同的NO给药方法（细胞内或细胞外）的疗效，并进一步探讨了其心肌保护作用的潜在机制。

基于MSCs的细胞治疗已被证明是治疗退行性疾病和组织损伤的强大解决方案。尽管自体干细胞比同种异体干细胞有优势，包括没有免疫排斥反应，但从慢性病患者身上采集的干细胞的存活率下降和旁分泌功能受损，极大地限制了其临床应用。

实验表明从糖尿病患者中收集的MSCs表现出细胞凋亡和炎症相关基因的显著上调和促血管生成基因的下调，从而影响细胞治疗的疗效。因此，经常需要基因工程策略来提高自体干细胞的治疗效果。最近的一项研究表明，eMSCs经过改造，在其表面表达PD-L1，并分泌CTLA4-Ig（免疫球蛋白）作为细胞外因子，表现出免疫保护特性，这改善了糖尿病小鼠同种异体和同种异体胰岛移植的结果。

从糖尿病患者和健康对照组收集的脂肪MSCs的转录组测序

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NO作为一种重要的信号分子，参与多种生理过程，在调节干细胞行为中发挥着关键作用，包括细胞存活、迁移、分化和旁分泌行为。这些因素影响干细胞与其他细胞的相互作用以及组织微环境。此前，团队已经制备了不同类型的释放NO的生物材料，如注射水凝胶，进一步的研究表明，NO和MSCs的组合在治疗各种疾病方面比单独的MSCs治疗更有效。此外，用释放NO的生物材料预处理MSCs可以提高MSCs及其分泌的外泌体的治疗效果，因为它们增强了促血管生成功能。

NO的细胞内输送抑制eMSCs的凋亡

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由于NO的时空特征，以位点特异性和可控的方式精确递送NO在外源给药NO的调节作用中具有重要意义。除了可控的释放速率外，由于相对半衰期和有限的扩散距离，产生NO的位点也是一个关键因素。有理由推测，在调节MSCs的生存和功能时，细胞内和细胞外NO递送可能导致不同的结果。团队基于凹凸策略设计了一种酶前药递送系统。突变型半乳糖苷酶（A4-β-GalH363A）能够靶向递送NO，从而减少由于NO前药的非特异性分解引起的副作用，提高治疗效果。团队将表达突变半乳糖苷酶的质粒转染到MSCs中，并成功构建了eMSCs。MSCs表达的酶可以催化6-OMe-半乳糖保护的NO前药的分解并在细胞内释放NO。

在eMSCs表达的A4-β-GalH363A催化下，从NO前药中细胞内产生NO

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蛋白质印迹和荧光成像表明，工程酶的表达仅限于MSCs的细胞核，而野生型β-半乳糖苷酶广泛分布在细胞质中，包括溶酶体和核周区。由于野生型β-半乳糖苷酶的相应前药是高度亲水性的，它不能进入MSCs，并通过从细胞转移的酶在细胞外释放NO。相反，突变半乳糖苷酶的前药由于其分子结构的改变而具有细胞穿透性；因此，它可以进入MSCs并在细胞表达的相应酶的催化下在细胞内释放NO。因此，本研究成功开发了两种不同的NO递送模式，并通过一系列评估（包括细胞成像和电子顺磁共振）进一步证实了这一点。进一步的体外和体内测定表明，与细胞外NO递送相反，细胞内给予NO增强了细胞存活和MSCs的旁分泌作用，包括抑制细胞凋亡和支持血管生成。

团队还建立了小鼠心肌梗死模型，系统评价骨髓间充质干细胞与外源性NO联合的治疗效果。结果表明，原位心肌移植后，NO的细胞内递送延长了eMSCs的滞留时间。此外，与仅使用MSCs治疗的组相比，eMSCs和细胞内NO递送的组合改善了MI后的心功能，并减少了不良的心室重塑。此外，它还可以有效地恢复血管网络的重建，进一步促进梗死心肌的修复。

NO的细胞内输送通过调节炎症和刺激血管生成，改善MI小鼠在eMSCs治疗后的心肌损伤

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为了进一步深入了解本研究中开发的联合治疗策略的转化潜力，建立了MI的大鼠模型，并在3天后通过第二次开胸给药MSCs，以模拟MSCs治疗MI的临床应用。临床上，急性心肌梗死通常是由于冠状动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成，从而导致冠状动脉阻塞。心肌梗死急性期后，不良的心室重构进一步影响患者的预后，其具体特征为心肌梗死区的心室壁厚度和心肌张力降低，非梗死区的心肌肥大，以及心室腔形态的改变，从而导致心律失常并进一步发展为心力衰竭。骨髓间充质干细胞治疗心律失常的疗效仍然是一个争论不休的话题。一些研究人员认为，MSCs似乎不能减少或预防心律失常，MSCs的抗心律失常或促心律失常潜力主要依赖于旁分泌因子。相反，其他研究表明MSCs本身可能在MI后恢复过程中发挥作用。在团队的研究中，观察到NO-eMSCs治疗后Cx43表达明显上调，这是一个与抗心律失常作用相关的潜在靶点。还需要进一步的研究来全面探索NO-eMSCs的抗心律失常潜力。与小鼠模型中增强的治疗效果一致，在大鼠心肌梗死模型中，NO的细胞内递送通过抑制细胞凋亡和增强间充质干细胞的旁分泌功能显示出巨大的优势。

NO的细胞内输送增强了大鼠MI模型中eMSCs的治疗效果

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综上所述，从糖尿病患者收集的骨髓间充质干细胞的存活率和旁分泌功能降低，这可能会极大地影响治疗效果。因此，成功构建了eMSCs，细胞表达的突变β-半乳糖苷酶能够通过外源性NO前药的转化在细胞内产生NO。体外和体内试验表明，NO的细胞内递送有效地提高了移植的MSCs的存活率，并促进了MSCs的旁分泌功能，与仅用MSCs治疗的组相比，小鼠和大鼠MI模型中的治疗效果增强，这进一步证实了这一点。这种协同策略为临床上自体骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死提供了一种选择。