靶向TROP2 的NDC在胰腺癌中展现强效抗肿瘤效果

前言

胰腺癌是一种高度侵袭性、发病率高、治疗选择有限的恶性肿瘤，迫切需要新的治疗策略。滋养层细胞表面抗原2（TROP2）在超过一半的胰腺癌患者的肿瘤细胞表面过表达，是开发新型ADC有吸引力的靶点。大部分ADC药物中抗体部分为传统抗体，其高DAR值和不稳定的连接体有可能增加不良事件的风险。

本期内容给大家介绍一篇文献报道，文章利用纳米抗体作为ADC的抗体部分，创新性地开发了一种靶向TROP2 的ADC（HuNbTROP2-HSA-MMAE），具备理想的亲和力、DAR值、内吞能力和抗肿瘤活性，为治疗TROP2阳性胰腺癌提供了潜在选择。

抗TROP2纳米抗体的筛选

通过筛选纳米抗体噬菌体文库，获得抗TROP2纳米抗体候选分子（图1A）。通过ELISA检测确定候选纳米抗体的亲和力（图1B），通过流式细胞术检测抗TROP2纳米抗体与表达TROP2细胞的结合活性（图1C）和内吞效果（图1D），最终选择了理想的抗TROP2纳米抗体Nb4进行人源化。

图1.抗TROP2纳米抗体的筛选。A.纳米抗体筛选流程图。B.ELISA检测候选纳米抗体的亲和力。C. 流式细胞术检测纳米抗体与TROP2细胞的结合活性。D.测量细胞内荧光强度来测定纳米抗体的内吞效果。

HuNbTROP2‑HSA‑MMAE的结构和结合特性

纳米抗体其血浆半衰期较短，为了解决该问题，研究者将人源化的Nb4与抗HSA纳米抗体连接，以延长体内半衰期，再通过MC-VC-PAB连接子与MMAE偶联，DAR值为1，最后得到ADC分子HuNbTROP2‑HSA‑MMAE（图2）。

该分子在ELISA检测中亲和力并未下降，在与人胰腺癌细胞系BxPC-3和PK-59的结合活性测定中，偶联MMAE并未影响人源化纳米抗体与细胞的结合活性。此外，HuNbTROP2-HSA-MMAE在人血清存在的情况下保持较高的稳定性，这在一定程度上模拟了ADC在体内遇到的情况，确保了其在体循环中的安全性。

图2. HuNbTROP2‑HSA‑MMAE的结构示意图。

HuNbTROP2‑HSA‑MMAE的内吞作用和体外抗肿瘤活性

ADC在细胞中的内吞及随溶酶体降解导致药物细胞毒性的释放是其治疗效果的关键。研究者用AF488荧光标记HuNbTROP2‑HSA‑MMAE，并用共聚焦显微镜观察其内吞作用和溶酶体降解。观察结果表明，HuNbTROP2‑HSA‑MMAE可以与细胞表面抗原结合，通过抗体介导的内吞作用进入细胞，与溶酶体融合，并进行溶酶体降解，这为有效载荷的细胞毒性提供了保证。

在MTT实验中，HuNbTROP2‑HSA‑MMAE对靶细胞表现出细胞毒性。HuNbTROP2‑HSA‑MMAE没有影响TROP2阴性细胞PANC-1的活力。在阳性细胞BxPC-3和PK-59细胞中观察到明显的剂量依赖性细胞毒性。此外，药物处理72 h对细胞的损伤大于处理48 h。同时，当NDC浓度超过1.25 μg/mL时，细胞活力不再显著下降，说明仅需要低剂量的HuNbTROP2‑HSA‑MMAE就能发挥强大的作用（图3）。

图3. A.HuNbTROP2‑HSA‑MMAE内吞到BxPC-3细胞中的过程。蓝色：细胞核；绿色：HuNbTROP2‑HSA‑MMAE。B. HuNbTROP2‑HSA‑MMAE内化后发生溶酶体降解。蓝色：细胞核；绿色：HuNbTROP2‑HSA‑MMAE；红色：溶酶体。C.用流式细胞术检测3种人胰腺细胞系表面TROP2的表达，用MTT法检测HuNbTROP2‑HSA‑MMAE处理2或3天后对这些癌细胞的细胞毒性影响。

HuNbTROP2‑HSA‑MMAE诱导细胞凋亡的机制

HuNbTROP2‑HSA‑MMAE通过抑制微管蛋白聚合，诱导有丝分裂抑制和细胞周期阻滞，最终促使细胞凋亡。实验证实，HuNbTROP2‑HSA‑MMAE孵育BxPC-3阳性细胞72h后，早期和晚期凋亡细胞的百分比呈剂量依赖性增加。Western Blot结果显示，HuNbTROP2‑HSA‑MMAE诱导细胞凋亡通过激活caspase-9和PARP裂解途径。同时，促凋亡蛋白Bax上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调。这些数据揭示了HuNbTROP2‑HSA‑MMAE可能通过caspase-9和PARP通路引发细胞凋亡。

图4. A.采用Annexin V-FITC/PI染色法检测HuNbTROP2‑HSA‑MMAE对BxPC-3和PK-59细胞凋亡的影响。AnnexinV+PI−（Q4）代表早期凋亡细胞，Annexin V+PI+（Q2）代表晚期凋亡细胞。B.对(A)的3个重复实验进行统计学分析凋亡细胞的比例为q2和q4之和。C. Western Blot结果显示，HuNbTROP2‑HSA‑MMAE处理72 h后，胰腺癌细胞中存在凋亡相关蛋白的表达。

HuNbTROP2‑HSA‑MMAE体内分布和代谢

在皮下移植肿瘤的免疫缺陷小鼠BxPC-3模型中，使用荧光标记的HuNbTROP2-HSA-MMAE静脉注射后，其快速分布到代谢器官，并在肿瘤中观察到明显的药物富集。24小时后解剖观察，药物在肝脏、肾脏和肿瘤中的高分布得到验证。随着时间的推移，药物逐渐被代谢器官清除，最终仅在肿瘤部位有显著富集和保留。这表明HuNbTROP2-HSA-MMAE在体内表现出优越的药物释放和靶向性能，为其在治疗TROP2阳性胰腺癌中的潜在应用提供了实验支持（图5）。

图5. A. 静脉注射200 μg Cy7-HuNbTROP2‑HSA‑MMAE治疗不同时间后的活体成像。B.注射24 h后在主要器官中的荧光分布。C.对样品中荧光强度的定量分析。

HuNbTROP2‑HSA‑MMAE体内抗肿瘤活性

使用不同剂量的HuNbTROP2-HSA-MMAE(0.2 mg/kg, 1 mg/kg, and 5 mg/kg)或阳性对照药物吉西他滨处理胰腺癌小鼠模型，治疗2周后，ADC处理组显示明显的肿瘤抑制。在第一次治疗后的第28天，与对照组相比，低剂量、中、高剂量HuNbTROP2‑HSA‑MMAE组的平均肿瘤抑制率分别为69.34%、76.22%和100%。在治疗结束后，持续监测小鼠的存活时间，用HuNbTROP2-HSA-MMAE处理的小鼠生存时间明显更长，尤其是高剂量组小鼠，超过60天仍健康存活。

组织学观察显示高剂量组肿瘤细胞数量减少，核分裂减少，Ki-67阳性细胞比例下降，说明HuNbTROP2-HSA-MMAE以剂量依赖方式抑制了肿瘤细胞增殖。此外，通过增加caspase-3和caspase-9的裂解，HuNbTROP2-HSA-MMAE诱导了细胞凋亡。这些结果支持HuNbTROP2-HSA-MMAE在体内表现出强大的抗肿瘤效果，为其作为治疗TROP2阳性胰腺癌的潜在选择提供了实证（图6）。

图6. A.使用不同剂量的HuNbTROP2‑HSA‑MMAE治疗4周期的肿瘤体积。B.接受不同治疗的小鼠的生存曲线。C.每条线代表单个小鼠的肿瘤体积。D H&E染色和IHC检测Ki-67阳性肿瘤细胞的caspase-3和PARP。

总结

研究者利用纳米抗体作为ADC的抗体部分具有良好的物理化学稳定性、水溶性好、组织穿透性高、内吞效率高、免疫原性低等优点，开发了一种新型TROP2靶向NDC（HuNbTROP2‑HSA‑MMAE）其具有良好的亲和力和内吞能力，可诱导细胞凋亡，在体内能够迅速分布到代谢器官，特异性富集在肿瘤部位。在胰腺癌小鼠模型中具有显著的抗肿瘤活性，包括抑制肿瘤生长、诱导细胞凋亡和提高小鼠生存时间。这一研究显示基于纳米抗体靶向TROP2的NDC是治疗TROP2阳性胰腺癌的有效策略，为开发胰腺癌和其他TROP2阳性肿瘤的治疗策略提供了新的可能性。

参考文献：

Xu C, Zhu M, Wang Q, Cui J, Huang Y, Huang X, Huang J, Gai J, Li G, Qiao P, Zeng X, Ju D, Wan Y, Zhang X. TROP2-directed nanobody-drug conjugate elicited potent antitumor effect in pancreatic cancer. J Nanobiotechnology. 2023 Nov 6;21(1):410. doi: 10.1186/s12951-023-02183-9. PMID: 37932752; PMCID: PMC10629078.

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