【期刊导读】临床治愈后肝内cccDNA水平和肝内HBsAg阳性比例、肝内HBV DNA整合和转录水平显著更低

 慢乙肝的完全治愈需要达到cccDNA和整合HBV DNA的清除，依靠现有的药物仍较难实现。基于当前临床治愈可以实现的前提下，患者可积极追求临床治愈。中山大学附属第三医院的高志良教授团队已发表研究表明慢乙肝患者获得临床治愈后肝内cccDNA水平和HBV整合显著降低，并有27%的患者获得了cccDNA清除。 近期，高志良教授团队和赵绮毅研究员团队再次发表相关研究，结果显示   临床治愈组的肝内cccDNA水平和肝内HBsAg阳性比例、HBV DNA整合和转录水平及肝内HBV RNA水平显著低于未治愈组，且肝内cccDNA和HBsAg均清除的比例达23.4%。肝内HBV RNA主要来源于整合HBV DNA。临床治愈患者若肝内残留HBsAg且具有cccDNA微量转录活性可能存在HBV复发风险。

 研究方法

  纳入2013年至2021年中山大学附属第三医院的临床治愈患者（n = 47）、未治愈患者（n = 21）和初治HBeAg阴性患者（n = 14）。临床治愈组包括接受PEG IFNα单药或联合NAs治疗获得临床治愈的患者。临床治愈定义为血清HBsAg清除（HBsAg < 0.05 IU/mL），血清HBV DNA < 20 IU/mL，血清HBV前病毒组RNA（pgRNA）< 15 copies/mL。至少间隔12周确认HBsAg清除。未治愈组包括接受PEG IFNα单药或联合NAs治疗的HBeAg阴性患者，但未达到HBsAg清除。初治HBeAg阴性组定义为未经治疗且ALT水平正常或轻度升高（低于2 ULN）的慢乙肝患者（简称初治组）。肝活检时患者已停止治疗。  

患者基线

三组之间的年龄、性别和ALT水平无明显差异。可能由于抗病毒治疗的原因，未治愈组的HBsAg（p < 0.001）和HBV DNA（p < 0.001）水平显著低于初治组。与初治组相比，未治愈组和临床治愈组的肝脏炎症活动程度显著降低（p =  0.004，p =  0.001），但肝纤维化程度无明显差异。此外，临床治愈组和未治愈组的肝脏炎症活动程度无明显差异。

患者基线

研究结果

0   1

临床治愈组的肝内cccDNA水平和肝内HBsAg阳性比例显著更低

临床治愈组的肝内共价闭合环状DNA（cccDNA）中位水平（1.49 log copies/103 cells）相比于未治愈组（2.16 log copies/103 cells，p = 0.004）和初治组（2.71 log copies/103 cells，p < 0.001）显著更低。临床治愈组的肝内HBsAg阳性比例显著低于初治组（0%，0 - 60.3% vs. 66.05%，0.95 - 99.90%，p < 0.001）和未治愈组（0%，0 - 60.3% vs. 17.50%，0 - 71.10%，p < 0.001）。未治愈组的肝内HBsAg阳性比例同样显著低于初治组（p = 0.001）。

临床治愈患者中25.5%仍有HBsAg阳性的肝细胞，HBsAg阳性肝细胞占比为0.1 - 60.3%。肝内HBsAg阳性的患者中，有8.5%的患者cccDNA水平低于LLOQ。临床治愈后肝内cccDNA和HBsAg均清除的患者比例达23.4%。在所有临床治愈患者中，肝内HBcAg的免疫组织学染色均为阴性，表明cccDNA可能不再产生pgRNA。

临床治愈组、未治愈组和初治组的（A）肝内cccDNA（B）肝内HBsAg阳性比例；（C）临床治愈患者中肝内cccDNA和HBsAg状态的分布情况

0   2  

临床治愈组的肝内HBV DNA整合和转录水平显著低于未治愈组

临床治愈组发生HBV DNA整合事件显著低于未治愈组（47.00 [15.00 - 160.00] vs. 196.00 [92.25 - 452.50]，p = 0.016）。同时，临床治愈组中的HBV DNA嵌合转录本明显低于未治愈组（2.00 [0 - 41.00] vs. 206.00 [113.50 - 439.00]， p < 0.001），提示HBV DNA整合及其转录水平的降低可能与HBsAg清除相关。伴随着总嵌合转录本的减少，肝细胞癌（LIHC）驱动基因中转录活跃的整合事件在临床治愈组中比未治愈组明显更低（0.50 [0 - 8.0] vs. 22.00 [13.00 - 49.00]，p < 0.001）。 

临床治愈组和未治愈组（A）HBV DNA整合事件数量（B）HBV DNA嵌合转录本数量肝癌驱动基因嵌合转录本数量

03  

临床治愈组的肝内HBV RNA水平显著低于未治愈组

临床治愈组中有 27.8%（5/18）的患者肝内HBV RNA检测不到，而未治愈组均可检测到肝内HBV RNA。临床治愈组的肝内HBV RNA中位水平显著低于未治愈组（1.52 [0 - 3.16] vs. 3.87 [3.64 - 4.15] log copies/103 cells，p = 0.004）。此外，临床治愈组的总HBV RNA reads数相比于未治愈组明显减少（50 [18 - 2485] vs. 15394 [10253 - 29231]，p < 0.001）。

临床治愈组和未治愈组（B）肝内 HBV RNA 水平

（C）总HBV RNA reads数

0   4  

临床治愈组中肝内HBsAg阴性患者的肝内HBV RNA水平显著更低

在临床治愈组中，肝内HBsAg阴性患者的肝内HBV RNA水平显著低于肝内HBsAg阳性患者（0.98 [0.00 - 1.87] vs. 3.87 [2.24 - 4.71] log copies/103 cells，p =  0.013）。临床治愈组中肝内HBsAg阴性的总HBV RNA reads数显著低于肝内HBsAg阳性的患者（24 [7.50 - 58] vs. 4751 [1726 - 24,486]，p = 0.002）。此外，与肝内HBsAg阴性患者相比，肝内HBsAg阳性患者的残留HBV整合事件（402.00 [90.00 - 569.50] vs. 30.00 [6.75 - 91.00]，p = 0.013）和嵌合转录本（83.00 [19.75 - 244.50] vs. 1.00 [0 - 4.25]，p = 0.005）显著更高。然而，临床治愈组中肝内HBsAg阳性和HBsAg阴性患者之间的cccDNA水平无显著性差异。

临床治愈组中肝内HBsAg阳性和阴性患者的（E） 肝内 HBV RNA水平（F）总HBV RNA reads数（G） HBV整合数量（H）HBV嵌合转录本数量 0 5  

肝内HBV RNA主要来源于整合HBV DNA，部分肝内HBsAg阳性患者表现出cccDNA微量转录活性

进一步确定肝内HBV RNA的来源，分析临床治愈组和未治愈组的嵌合转录本与肝内HBV RNA水平之间的相关性，观察到高度相关性（r =  0.924，p <  0.001）。此外，整合HBV DNA水平与肝内HBV RNA水平呈强正相关（r =  0.806，p < 0.001）。相比之下，cccDNA与肝内HBV RNA的相关性较弱（r = 0.534，p = 0.004）。上述结果表明两组的肝内HBV RNA主要来源于整合HBV DNA。此外，对HBV RNA和嵌合转录本覆盖率的分析证实，HBV转录主要源自整合HBV。临床治愈组中部分肝内HBsAg阳性的患者仍有cccDNA微量转录活性。未治愈组均显示出cccDNA转录活性。

肝内HBsAg阳性的临床治愈患者的肝内HBV RNA水平与（A）嵌合转录本（B）整合HBV DNA（C）cccDNA之间的相关性;（D）6例患者的HBV RNA（蓝色）和嵌合转录本覆盖率（粉色）

0 6  

肝内残留HBsAg且具有cccDNA微量转录活性的临床治愈患者可能存在HBV复发风险

对完成RNA测序的临床治愈患者（n ≥ 18）进行定期随访，4例肝内残留HBsAg的患者仍保留有cccDNA微量转录活性，其中2例出现HBV复发。2例肝内残留HBsAg但无cccDNA微量转录活性的患者，在至少108周的随访期间未发生HBV复发。同样，无肝内残留HBsAg的临床治愈患者（n = 12），在96周（87 - 129）随访期间未发生HBV复发。

对完成RNA测序的临床治愈患者进行随访（A）具有整合HBV转录活性和cccDNA微量转录活性的临床治愈患者（B）仅具有整合HBV转录活性的临床治愈患者

肝霖君有话说

临床治愈后cccDNA和整合HBV DNA的清除有利于降低疾病复发风险。本研究再次证实了获得临床治愈的患者肝内cccDNA水平和HBV DNA整合显著降低，且肝内cccDNA和HBsAg均清除的比例达23.4%。此外，临床治愈患者的肝内HBsAg阳性比例和HBV RNA水平同样显著降低，而HBV RNA主要来源于整合HBV DNA。

另外，该项研究的患者是通过PEG IFNα单药或联合NAs治疗策略实现临床治愈的。已有多项探索干扰素清除cccDNA的机制研究，包括通过改变组蛋白的修饰等表观遗传学的方式、通过巨噬细胞分泌的外泌体携带的miRNA作用、依赖于ISG20与APOBEC3A协同作用等来抑制cccDNA。相信随着未来更多机制相关研究、检测标志物的探索，将会更加接近完全治愈的目标。

参考文献：  

Gao N, Guan G, Xu G, et al. Integrated HBV DNA and cccDNA maintain transcriptional activity in intrahepatic HBsAg-positive patients with functional cure following PEG-IFN-based therapy[J]. Aliment Pharmacol Ther, 2023, 58(10): 1086-1098.