CRISPR/Cas12a基因组编辑技术及其在生物领域的应用

关键字：CRISPR/Cas12a; 基因组编辑; 转录调控

摘要：CRISPR/Cas系统是近年来被广泛应用于基因组编辑的一项新兴技术,其中CRISPR/Cas12a技术由于具有独特的优势,受到越来越多的关注

基因组编辑(genomeediting)是对细胞内的目标遗传物质进行特定改造的一种技术，包括DNA删除、替换、插入、易位、点突变等。基因组编辑技术在分子生物学领域发挥着重要作用，通过对目的基因进行特异性修饰来研究基因的功能。

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated proteins)系统来源于细菌和古细菌的适应性免疫系统，是近年来被广泛应用于基因组编辑的一项新兴技术。目前，CRISPR系统已被大量挖掘，其中Ⅱ类CRISPR/Cas9作为基因组编辑工具已被广泛应用于微生物、植物和动物。除了CRISPR/Cas9，同属于Ⅱ类的CRISPR/Cas12a技术由于具有独特的优势，受到越来越多的关注。

CRISPR/Cas是细菌和古细菌中一种适应性免疫系统，赋予细菌抵抗外源可移动基因元件(mobilegeneticelement,MGE)入侵的能力。免疫系统发挥功能由三个步骤完成:(1)适应阶段。Cas1和Cas2复合蛋白识别外源DNA，并将DNA进行剪切获得新的间隔序列，之后整合到CRISPR阵列中以形成免疫记忆。(2)表达阶段。CRISPR阵列转录生成pre-RNA，随后原间隔序列与直接重复序列被加工为成熟的RNA，称为CRISPRRNAs(crRNAs)。crRNA与Cas蛋白结合以形成具有活性的Cas-crRNA复合物。(3)干扰阶段。crRNA作为向导(gRNA)识别外源基因组中与间隔区相似的序列，由Cas核酸酶进行切割，细菌最终实现对外源MGE的抵抗。

CRISPR/Cas系统是通用的免疫系统，其原则上可以保护宿主免受任何MGE的侵害。由于这种普适性，CRISPR/Cas系统广泛存在于40%的细菌和90%的古细菌中，这也决定了CRISPR/Cas系统的多样性。CRISPR/Cas系统包括两个大类、6个类型和33个亚型。根据Cas效应蛋白的组成不同，CRISPR/Cas系统分为两大类:第一类是多蛋白效应复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型;第二类是单个Cas蛋白复合物，包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅵ型。与一类相比，二类系统在基因组编辑和基因筛选的应用中具有更大的潜力，因此被更多地研究、开发和利用，如Ⅱ型Cas9(Csn1)、Ⅴ型Cas12a(Cpf1)、Ⅵ型Cas13a(C2c2)和Cas13b(C2c6)系统。各类型的作用机制取决于各自不同的Cas蛋白和gRNA，这为基因组编辑提供了多种选择。其中，经典的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统，经过不断地开发和改良，是目前应用最广的基因组编辑技术。与Ⅱ型CRISPR/Cas9系统一样，Ⅴ型Cas12a(原名为Cpf1)系统也被认为是具有良好应用前景和研究价值的基因组编辑技术之一。

CRISPR/Cas12a的特点

Cas12a属于CRISPR/Cas系统，具有被开发为基因组编辑技术的巨大潜力。CRISPR/Cas12a系统产生切割必须满足三个条件:Cas蛋白、crRNA和PAM。Cas蛋白是发挥识别、切割功能的蛋白，crRNA为靶向指引，PAM是CRISPR/Cas系统区分自我和入侵者的标记。Cas12a蛋白由1200~1300个氨基酸组成，略短于SpCas9(来源于Streptococcus)的1368个氨基酸。Cas12a具有两个瓣叶结构:核酸酶瓣叶(nucleaselobe,NUC)和α-螺旋识别瓣叶(alpha-ahelixrecognitionlobe,REC)。

CRISPR基因组编辑技术作用机制及Cas蛋白结构域

REC由REC1和REC2两个结构域组成，而NUC由RuvC结构域、NUC结构域和PI、WED、BH三个附加结构域组成。Cas12a的核酸内切酶结构域RuvC具有切割双链DNA的能力，对于核酸酶的活性至关重要。Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个核酸内切酶结构域，分别切割模板和非模板链。

表  CRISPR/Cas9与CRISPR/Cas12a的区别

项目——CRISPR/Cas9——CRISPR/Cas12a

Cas蛋白大小——1000~1600aa——1200~1300aa

crRNA长度——100~200nt——42~44nt

crRNA类型——双链——单链

原间隔序列邻近基序——3'-GGN(SpCas9)——5'-TTN(FnCas12a)

核酸内切酶结构域——RuvC和HNH——RuvC和Nuc

加工pre-crRNA——RNaseⅢ——Cas12a

切口类型——平末端——黏性末端

多基因编辑效率——低——高

CRISPR/Cas12a的作用机制

在真核生物中，自然发生同源重组的概率极低，如在酵母和小鼠细胞中，每104~107个细胞中仅有一个细胞自然发生供体基因和目标基因的同源重组，而DNA损伤会使同源重组的概率大幅度增加。因此，无论是传统的锌指核酸酶系统、类转录激活因子效应物系统，还是CRISPR/Cas系统，三者实现靶向基因组编辑的原理一致，即通过靶向核酸酶实现目标DNA单链或双链断裂使DNA发生损伤，激发细胞NHEJ或HDR。HDR依赖同源模板发生同源重组，进行精确的基因组编辑;NHEJ则是通过DNA连接酶将断裂末端直接连接修复，不依赖于同源DNA序列，往往发生错配，从而破坏目标位点序列。

CRISPR/Cas12a系统实现基因组编辑主要通过识别、切割和修复三个步骤完成。首先，CRISPR序列进行转录产生pre-RNA，Cas12a自行对pre-RNA加工切割生成成熟的crRNA，crRNA通过与核酸内切酶的WED、RuvC和REC2结构域以及两个Mg2+离子的相互作用形成单核酸酶效应复合物。效应复合物首先扫描5'-TTN-3'PAM位点，之后通过碱基互补配对原则使crRNA间隔序列与目标DNA同源序列结合，将Cas12a特定靶向结合到目标位点。Cas12a使用RuvC核酸内切酶结构域对DNA实现远离PAM交错切割，同时将PAM远端切割产物释放，产生长度为4~5nt突出的黏性末端缺口。随后，细胞启动修复机制以修复损伤缺口。NHEJ和HDR是真核细胞内主要的DSB修复机制，NHEJ可造成移码突变使基因功能失效，部分原核细胞缺乏NHEJ，但若添加外源修复模板(一般500~1000bp左右同源臂)，也可通过HDR修复实现精准的基因插入或替换。实验可选择是否加入同源模板诱导不同的修复机制，从而实现不同的基因组编辑目的。可见，CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas9系统在crRNA加工、靶向切割、PAM识别的机制方面明显不同，CRISPR/Cas12a的作用机制更加简洁，Cas12a能够自行加工crRNA，因此可应用于多基因编辑。

CRISPR/Cas12a转录调控模型

与cas9相同，CRISPR/Cas12a可以被开发为多种基因组编辑工具，如转录调控、基因重组、碱基编辑等。其中，CRISPRi、CRISPRa及碱基编辑由于不造成双链DNA断裂，也不需要同源模板和引发NHEJ，能够有效避免DSB造成的染色体突变、细胞死亡等问题，有望比原始的CRISPR系统适用于更广泛的对象。筛选不同的转录因子，利用不同物种来源的Cas12a，同时结合不同来源的重组酶、crRNA修饰、蛋白质工程产生Cas12a突变体，通过这些技术开发CRISPR/Cas12a基因组编辑工具和改进编辑效率与精度，已在微生物、哺乳动物等物种中发挥了功能，这将有助于基因编辑技术的进一步发展。

参考文献

Xin-ru, CHEN Mao-sen, ZHONG Jie, QI Feng. Characteristics and Application of CRISPR/Cas12a Genome Editing Technology. Journal of Chinese Biotechnology, 2023, 43(10): 32-42 doi:10.13523/j.cb.2304020

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