LNP共递送mRNA和siRNA→PD1lo CAR-T细胞

PD-1信号通路是肿瘤微环境中T细胞活性减弱的主要来源。虽然抑制PD-1通路的临床方法（如抗体阻断）已经取得了广泛的成功，但这些方法导致了广泛的PD-1抑制，增加了自身免疫反应的风险。宾夕法尼亚大学 Michael Mitchell 教授团队联合CAR-T细胞疗法先驱 Carl June 教授和mRNA技术先驱  Drew Weissman 教授，报道了一种LNP平台的发展，用于同时在T细胞中实现治疗基因表达和RNA干扰（RNAi）介导的暂时性基因敲低。在开发这个平台时，观察到两种RNA货物在共同封装时有趣地相互作用，相比单独传递货物提高了表达和敲低特性。这种mRNA/小干扰RNA（siRNA）共递送平台被采用来向人原代T细胞外递送到CAR mRNA和靶向PD-1的siRNA，并且观察到了强烈的CAR表达和PD-1敲低而没有明显的整体T细胞激活状态变化。这种递送平台显示出巨大的潜力，可以临时调节免疫基因，包括开发改进的肿瘤免疫疗法在内的许多免疫工程应用。

CAR-T细胞疗法近年来作为对抗癌症和其他疾病的有力工具，在临床实践中不断获得认可。CAR-T疗法已被批准用于治疗ALL、B细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤，并正在研究用于NSCLC、胶质母细胞瘤、HIV、心脏损伤等。CAR-T疗法的强大效果的一个主要来源是这些疗法能够利用患者的自身免疫系统发起针对癌细胞的复杂进攻。然而，CAR-T疗法作为免疫系统的延伸意味着工程化的CAR-T细胞容易受到肿瘤微环境（TME）中免疫抑制信号的影响，从而阻碍CAR-T疗法的效果。

PD-1信号通路已被确立为T细胞活性在TME中的主要抑制者，包括在接受CAR-T细胞疗法时。PD-1（CD279），一种免疫检查点受体，在激活的T细胞表面表达。当与其中一种配体（PD-L1或PD-L2）结合时，PD-1会启动免疫抑制反应，通过促进效应T细胞的凋亡和抑制调节性T细胞的凋亡来遏制炎症性T细胞活性。虽然PD-L2的表达相对有限，但PD-L1在各种肿瘤中过度表达，并被认为在免疫逃逸方面起着重要作用，特别是降低CAR-T细胞的功效。因此，抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用作为恢复CAR-T细胞功效的潜在手段引起了极大的兴趣。

通过阻断抗体阻断PD-1及其配体是克服免疫抑制PD-1通路的一种广泛使用的临床策略。虽然将阻断性抗体与CAR-T细胞疗法结合是一种有效的方法，但抗体的给药会导致PD-1信号传导的广泛抑制，从而可能导致自身免疫反应。CAR-T疗法对自体T细胞进行工程改造以表达外源性CAR，因此有可能通过靶向PD-1抑制来产生具有抑制PD-1信号传导的CAR-T细胞，同时在其他地方保留PD-1通路。这种方法是在CAR工程的同时破坏PD-1通路，并已通过几种方法进行了研究，包括使用CRISPR-Cas9介导的PD-1敲除、整合工程化的抗PD-1 scFv和表达针对PD-1的短发夹RNA(shRNA)等。然而，大多数这些方法都依赖于通过病毒基因递送和/或CRISPR-Cas9基因编辑改变基因组。这意味着这些PD-1抑制措施是永久性的，创建出对这种抗炎信号通路永久脱敏的T细胞，为自身免疫反应打开大门。然而，T细胞配备内源性的遗传转录瞬时抑制机制，即RNA诱导沉默复合物(RISC)。因此，在转录水平上使用RNA干扰（RNAi）暂时破坏PD-1信号通路提供了一种吸引人且未充分探索的替代当前方法的选择。

该宾夕法尼亚团队报告了一种非病毒平台的发展，该平台通过使用LNPs递送CAR编码的mRNA，用于生产短暂的CAR-T细胞。在本研究中，将这一平台增强，以实现外源性mRNA的同时表达和使用RNAi任意内源基因的临时中断。使用工程化的LNP平台在体外向T细胞传递CAR mRNA和针对PD-1的siRNA，生成具有强大但短暂CAR表达和暂时细胞内在PD-1中断的人T细胞。这些“超级”CAR-T细胞，在完成其功能后，可以恢复到正常患者T细胞的功能，极大地限制了由于CAR表达和PD-1抑制引起的脱靶效应的范围。结果显示由于共同封装导致的mRNA和siRNA货物之间的有趣相互作用，这表明即使在不需要基因沉默的应用中，siRNA的纳入可能对LNP介导的mRNA递送有益。

可电离脂质合成和LNP配方

为了开发用于T细胞共同传递mRNA和siRNA的LNPs，制备了含有四种主要脂质成分的LNPs（图1b）。这些成分包括可离子化脂质，对于内体逃逸和货物释放到胞质中至关重要；“辅助”磷脂，有助于封装和LNP膜形成；胆固醇，为膜稳定性与融合提供支持；以及锚定在脂质上的PEG，延长循环时间并限制与固有免疫系统的相互作用。本研究的所有LNP配方中都使用了新型离子化脂质C14-494，之前被称为“C14-4”，因为先前已证明这种脂质的LNPs在体外和体内具有强大的mRNA递送能力。为了生产C14-494离子化脂质，将494多胺核心与过量的14碳烷基环氧尾部反应，产品鉴定和纯度通过LC-MS得到确认（图1a）。在这项研究中，调查了两种“辅助”脂质：DOPE，它通常用于mRNA递送的LNP配方中；以及DSPC，历史上用于siRNA封装。为了制备LNPs，在乙醇中混合所有脂质成分，并与包含mRNA和/或siRNA的水性溶液混合，使用微流控设备进行混合，该设备由交错的鱼骨搅拌器制成。制备后，使用标准方法表征了LNP的亲水尺寸、多分散度、zeta电位、离子化性和RNA包裹。观察到LNP的pKa值介于5和7之间，表明其在晚期内体中的可离子化特性（图1c）。LNPs通常是单分散的，直径通常低于100nm（图1d）。

图1

用于体外双重RNA递送的赋形剂组合的筛选

为了开发双RNA递送到T细胞的LNPs首先调整LNPs的组成以容纳混合货物的mRNA和siRNA。为此，设计了一个库的LNPs与辅料组合的变化沿从“siRNA样”的“mRNA样”的连续性基于先前的研究【Lipid Nanoparticle Formulations for Enhanced Co-delivery of siRNA and mRNA】。虽然这项之前的研究确定了辅料组成的共同传递的mRNA和siRNA，交付优化可能会根据细胞类型和离子化脂质结构，因为离子化脂质结构已被证明对LNPs的转染特性产生显著影响，和新型离子化脂C14-494比以前研究过的离子化脂为双重RNA递送具有实质上不同的化学结构。

为了研究赋形剂组成对体外RNA共递送到T细胞的影响，将编码mCherry的mRNA和靶向EGFP的siRNA共包封在不同赋形剂成分的LNP中（表1）。表征显示，对于模拟，“siRNA样”制剂中的LNP流体动力学直径通常高于“mRNA样”制剂（图2a）。所有观察到的z-平均直径都在150nm以下，几乎所有的多分散指数（PDI）都在0.3以下。值得注意的是，RNA包裹在包含DOPE的配方中要高得多——只含有DSPC作为磷脂的配方W1显示了63.8％±1.0％的包裹效率，而所有其他配方都显示出了至少88％的平均包裹效率（图2d）。特别是，配方W4和W5，最“mRNA样”的配方，实现了高达97％的平均包裹效率，并且其封装的RNA浓度约为配方W1的6倍（图2c,d）。配方W1的ζ电位适度为负（平均值为-13.9mV），这可能是由于其相对较差的RNA封装，但随着包裹效率的提高，ζ电位逐渐变得更加积极，达到配方W5的轻微正电位（平均值为6.35mV）（图2b）。

表1 在Jurkat细胞中筛选用于双重RNA递送的赋形剂组合物。W1配方是siRNA递送典型LNP配方的代表，而W5配方是mRNA LNP配方的典型代表。通过改变赋形剂来探索这两个极端之间的设计空间（配方W2-W4）。

图2

为了方便起见，使用Jurkat细胞对T细胞核酸共递送进行研究，Jurkat是一种公认的永生化人类T细胞系，通常用于免疫模型。用含有mCherry mRNA和EGFP siRNA的LNP以每100000个细胞50ng的包封mRNA的剂量处理稳定表达EGFP的Jurkat细胞。1天后，使用流式细胞术分别量化mCherry和EGFP荧光作为mRNA递送和siRNA递送的测量，并使用荧光显微镜进行二次确认（图2e–h）。通过比较未经处理的EGFP+Jurkat细胞和未经处理的野生型（EGFP-）Jurkat细胞来量化EGFP敲低。评估mCherry表达为阳性率，通过比较未经处理的野生型Jurkat细胞。这个筛选确定了配方W4和W5作为在体外介导mRNA和siRNA的最大功能递送，mCherry阳性率为91.4%±5.1%和90.5%±5.0%，明显的EGFP敲低量分别为26.3%±2.8%和30.1%±3.9%。重要的是，蛋白组学测量的EGFP敲低可能低估了siRNA递送的实际转录组效应；然而，这仅影响绝对定量，并不妨碍将蛋白组学测量作为相对siRNA递送的替代方法。由于配方W5具有优越的敲低特性，两个领先配方之间的mRNA递送无法区分，以及配方W5的相对简单性（只包含四种辅料，而配方W4则包含五种辅料），选择配方W5的辅料组成进行进一步优化。

核酸货物组成对体外双重RNA递送的影响

之前的研究表明，在mRNA和siRNA共转染时，每种核酸的存在和相对数量可能会影响另一种核酸的递送。为了研究货物组成对递送的影响，设计并制备了包含固定量mCherry mRNA但EGFP siRNA可变量的LNPs，以及仅含EGFP siRNA的siRNA对照（表2）。表征结果显示这些LNPs具有通常有利的物理化学特性，所有z平均直径观察到低于100nm，且一般略带正电荷。然后，用这些LNPs来转染稳定表达EGFP的Jurkat细胞。为了探究相对mRNA量对siRNA递送的影响，在固定剂量为每个100000个细胞2ng siRNA的情况下处理细胞。为了研究相对siRNA量对mRNA递送的影响，分别在固定剂量为每个100000个细胞33.3ng mRNA的情况下单独处理细胞。24h后，通过流式细胞术测量mCherry和EGFP荧光，并通过与未经处理的EGFP+和野生型Jurkat细胞进行比较，确定阳性率和敲低量，并通过荧光显微镜确认转染（图3）。有趣的是，mRNA含量似乎适度影响siRNA介导的敲除，与siRNA对照组LNP X6相比，适量的额外mRNA增强了LNPs的抑制作用(图3b,f)。

表2 在Jurkat细胞中进行的核酸组合体外双RNA递送测试。配方X1用作mRNA对照，而配方X6用作siRNA对照。X中所有配方所使用的赋形剂均基于配方W5。

具体来说，siRNA对照配方X6在固定剂量为每100000个细胞2ng的siRNA下，显示出EGFP敲低率为15.4%±7.9%，而含有mRNA的配方X3显示了29.2%±5.4%的EGFP敲低率。同样地，增加siRNA含量显著提高了mRNA递送到某一程度，之后额外的siRNA对mRNA表达的影响很小，与先前的报告一致（图3a,c）。mRNA对照配方X1实现了39.9%±12.7%的mCherry转染，而含有siRNA的配方X3在固定剂量为每100000个细胞33.3ng的mRNA下，实现了显著的92.4%±7.5%的转染。配方X3是用mRNA:siRNA重量比为25:3制备的，并显示出所有测试配方中最大的敲低和最大的mRNA表达，因此在这项研究中脱颖而出，成为T细胞共递送的LNP领先配方，并作为治疗RNA封装LNPs的基础。

图3

人原代T细胞体外PD-1敲低的动力学

为了验证PD-1敲低在人原代细胞中经PD-1 siRNA处理后的效果，并确定后续研究适用的条件，进行体外PD-1敲低动力学研究。将易于获取的EGFP mRNA作为CAR mRNA的动力学研究替代品。使用通过体外筛选确定的辅料组成和核酸比（配方X3），在LNPs中将EGFP mRNA与靶向人PD-1的siRNA共同封装。激活原代人T细胞过夜，然后以每100000个细胞300ng的封装mRNA剂量对其进行治疗。在转染后立即以及接下来的8天内每天进行定量，使用流式细胞术量化EGFP和PD-1的表达（图4）。EGFP表达数据揭示了强烈的mRNA表达，从转染后1天开始，最大表达（对应于近99％的转染）发生在转染后2天（图4a,b）。

图4

值得注意的是，这个表达式相当持久，荧光检测持续了整个8天的研究。然而，由于EGFP在细胞质内的半衰期相对较长（大约为1天），因此很难精确确定mRNA翻译的发生时间有多长。此外，PD-1表达数据显示出强烈的和持久的siRNA介导的PD-1敲低，最大的减少（大约60%）发生在转染后1天（图4c,d）。在转染后4天观察到PD-1表达水平短暂恢复至基线水平，这可能需要进一步探索以提高对CAR-T制造中检查点受体表达的理解。尽管如此，PD-1敲低至转染后的7天，与mRNA表达持续时间接近一致。这种CAR表达和PD-1抑制的同步是可取的，以便在CAR疗效的关键窗口期内实现免疫检查点脱敏，同时通过恢复免疫检查点相互作用来最大程度地减少CAR表达消退后的脱靶自身免疫风险。根据观察到的转染后1天的翻译和敲低特性，选择这个时间点进行后续实验。

体外工程制造PD-1(lo)人CAR-T细胞

在建立原代细胞实验的剂量和时间参数后，接下来进行治疗基因表达测定。使人类原代T细胞过夜激活，并用封装核苷修饰的cap1 CAR mRNA和PD-1 siRNA的LNPs（配方X3）按照每100000个细胞500ng的包裹mRNA的剂量进行处理。作为对照组包括只封装CAR mRNA的LNPs和封装CAR mRNA和随机siRNA的LNPs。第2天，为了确认CAR表达，准备样品进行荧光成像、细胞核和膜染色以及表面CAR和PD-1表达，并通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）获取图像。所有处理过的样本都检测到了CAR表达（图5），在双封装的LNPs处理组中，CAR表达有明显的定性增加。

图5

确认CAR表达后，再次激活细胞过夜，并用封装了CAR mRNA、CAR mRNA和PD-1 siRNA或CAR mRNA和scrambled siRNA的LNPs处理它们。第2天，通过流式细胞术评估CAR和PD-1的表达。同时测量了激活标记CD25、CD62L和CD69以及T细胞标记CD3、CD4和CD8的表达（图6）。引人注目的是，观察到了非常强的CAR表达（高达近71％的转染率），在所有情况下，siRNA的加入似乎都增强了这种表达，这与报告基因实验的结果一致，也符合显微镜下的观察结果，代表了CAR-T工程效率相对于之前报道的重大改进（图6a,b）。用封装了CAR mRNA的LNPs处理过的T细胞在存活的T细胞中显示出49.4％±5.7％的转染，而用PD-1 siRNA或随机siRNA共包封CAR mRNA的LNP处理的细胞分别显示出64.0%±4.7%或67.8%±1.9%的转染。没有观察到辅助T细胞与细胞毒性T细胞之间的CAR表达差异，这表明T细胞亚型的均匀转染（图7）。观察到中度的PD-1敲低（图6c-d）。有趣的是，当用仅包含CAR mRNA的LNPs处理细胞时，对于一些donor来说，看到了相对于未经处理的细胞PD-1表达的降低。当同时封装CAR mRNA和PD-1 siRNA时，观察到PD-1表达进一步降低了23.6%±0.7%（图6d）。当用同时封装CAR mRNA和随机siRNA的LNPs处理细胞时，与单独使用CAR mRNA处理的细胞相比，没有观察到PD-1表达有任何显著差异，这表明这种敲低依赖于封装siRNA的序列，正如预期的那样。此外，无论治疗如何，激活标记物CD25、CD62L和CD69的表达水平似乎都相同，这表明抑制PD-1表达并没有改变CAR-T细胞在CAR-T生成过程中的激活状态（图6e-g）。总的来说，这些结果证明了将siRNA与治疗性mRNA一起封装的实用性，并能够在人原代T细胞中有效地递送两种货物，从而实现具有暂时性免疫检查点抑制的治疗相关“超级”CAR-T细胞的体外生成。

图6

图7

总结

在这个研究中，开发了一个LNP平台用于在T细胞中同时进行基因表达和特异性基因破坏。在一个LNP配方中同时封装mRNA和siRNA比分别封装和递送货物对T细胞输送更有效。选择了一种领先的LNP候选物，因为它在Jurkat细胞体外具有强大的mRNA和siRNA递送能力，并使用这种配方抑制人原代T细胞中PD-1的表达，观察到强大而持久但短暂的敲低以及长期、强烈的外源性mRNA表达，每一种至少可以检测到一周。然后，将领先配方进行了适应，以从原代细胞体外产生具有整合免疫检查点抑制的人类CAR-T细胞，注意到与仅mRNA-LNPs相比，CAR表达有所改善，并成功实现了依赖于siRNA序列的PD-1敲低，而不会改变生成的CAR-T细胞的整体激活状态。观察到，即使使用随机的siRNA序列，mRNA转染也有所改善，这与之前的一份报告一致，并表明添加siRNA（即使在不严格要求RNAi的应用中）也可能广泛有益于基于mRNA LNP的治疗。这项工作的潜在未来方向包括沉默其他基因（包括其他免疫检查点受体，如CTLA-4、LAG-3和A2AR，但也可以是其他具有治疗意义的基因，无论是单独还是组合），并扩展到其他治疗性mRNA，如工程化的TCRs和细胞因子，以及其他免疫细胞类型。

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