Ä文献｜纳米抗体在前列腺癌诊断及治疗中的研究

   根据数据，前列腺癌占男性新发癌症的27%，是男性第二大常见癌症。尽管前列腺癌患者的生存期较长，但若晚期缺乏有效的治疗仍然会导致预后不良。因此，面对日益增加的癌症负担，我们必须积极探索新的治疗途径。

前列腺特异性膜抗原 (PSMA)

   前列腺特异性膜抗原 (PSMA) 是一种在细胞膜上表达的跨膜糖蛋白。研究表明，PSMA在前列腺癌 (PCa) 中表现出特定的高表达模式，在正常组织（前列腺、小肠、唾液腺和泪腺、肾脏）中表现出低表达模式，其表达水平与PCa的侵袭性高度相关，PSMA的胞外结构域较大，易于设计靶分子。这些特性吸引了许多研究人员的注意，使PSMA成为前列腺癌的经典靶点。目前，已经发现的与PSMA胞外区域具有足够高亲和力（nmol范围）的蛋白质大多是单克隆抗体或抗体片段。但由于抗体的血清半衰期长、生物分布广、降低信噪。当抗体与细胞毒性放射性同位素结合时，毒性作用可能会增加，且较大的尺寸也阻碍其渗透到异常肿瘤组织核心的能力，降低其给药效率。

纳米抗体 (Nb)

   20世纪90年代初，科学家在骆驼的血清中检测到一类特异性重链抗体 (hcAb) ，这些hcAb不含有传统抗体的轻链结构，且功能性抗原结合蛋白可被简化为单个可变结构域，这种单个可变结构域分子量约为15 kDa，因此通常被称之为纳米抗体或单域抗体 (Nb/VHH) ，纳米抗体是迄今为止获得可稳定结合抗原的最小抗体单元。此外，纳米抗体相比于传统单抗分子，由于分子量小，可直接穿透致密的组织能力，且结构上相比于传统的VH，有更长的抗原结合域，与抗原亲和力更强，纳米抗体 (Nbs) 的出现在一定程度上弥补了传统抗体的不足。由于以上的优点，纳米抗体常用于各种肿瘤的诊断和治疗中，譬如前列腺癌的诊断。

纳米抗体实验案例

   作者通过向骆驼注射PSMA细胞外结构域，使其产生免疫。从骆驼淋巴细胞中分离RNA，并逆转录为DNA，将编码VHH片段的DNA扩增并连接到pMESC质粒载体上，并用于感染TG1大肠杆菌感受态细胞，并通过M13辅助噬菌体感染用于噬菌体展示文库建立。经过两轮针对PSMA的筛选，使用ELISA对菌落进行评估、然后进行测序，选定了四种NBs（NB7、NB8、NB13和NB37），并将其编码DNA转化到WK6大肠杆菌中诱导表达生产，产量为4-18 mg/L。得到的上清液，先使用Ni-NTA重力柱进行亲和捕获，洗脱得到的目标NB组分使用HiLoad 16/600 Superdex 75凝胶过滤层析进行精纯，具体实验流程如图1所示。对获得的组分通过SDS-PAGE凝胶电泳和质谱分析NB的大小和纯度，确认得到预期大小 (~16 KD) 的NB，纯度超过95%，结果如图2所示。

图1：纳米抗体纯化流程示意图

图2：NB筛选以及纯化结果，A：ELISA结果显示与PSMA结合的不同NB序列的单个菌落，彩色表示不同的序列（黄色：NB7、红色：NB8、蓝色：NB13、绿色：NB37）；B：NB7的凝胶过滤结果图（NB8、NB13、NB37类似）；C：SDS-PAGE结果显示四种纯化的NBs，所有NB预期大小均为~16 KDa

   作者后续通过分子互作实验得到更多发现，结果显示四种NBs都展现了与PSMA的亲和力，且结合位点属于不同的PSMA结合表位，因此可选择不同潜在位点进行应用设计。其中NB8和NB37对PSMA的亲和力较低，体内清除相对较快，因此适用于诊断，相反NB7亲和力最高，半衰期长，且能有效内化到肿瘤细胞中，因此适合与DOX等细胞毒性药物偶联用于治疗。

   异种移植物胸腺裸鼠体内实验证明，四种NBs均需要24h以上消除信号，亲和力高的NB7实验证明需要56h，说明这四种纳米抗体均可能用于体内应用，如临床成像和肿瘤特异性药物输送。在体内实验16小时后，NB7cysDOX（C端半胱氨酸修饰，且偶联了细胞毒性分子的NB7）大部分完成内化，小部分仍结合在肿瘤细胞膜上，由于膜的酸性环境，可水解NB7与DOX之间的化学键，将药物释放到肿瘤微环境中，引起“旁观者效应”，同样有益于治疗。

   小鼠实验证实了上述结果，DOX高剂量处理与NB7偶联低剂量DOX呈现类似结果，两组肿瘤生长速度相似，对照组（生理盐水）肿瘤生长最大。实验结果如下图所示。

图3：NB7cysDOX在体内抑制肿瘤生长结果，胸腺裸鼠PC3-PIP异种抑制物分别用生理盐水（对照）、DOX (2 mg/kg) 及NB7超音速DOX (1.4 mg/kg) 处理。A：治疗期间每周2次测量肿瘤体积。B：各时间点小鼠存活的百分比。绿色：对照组 (n=7) ，红色：DOX (n=8) ，蓝色：NBcysDOX (n=8)

总 结

   作者表示，分离得到的四种NBs与PSMA抗原都具有高亲和力，以及内化到靶细胞的能力，使之成为与细胞毒性小分子药物结合有利的候选者。且越来越多的证据暗示，NB及NB-药物偶联物是基于抗体治疗和显像剂有利的替代品，促进开发高效的NBs用于肿瘤检测和靶向药物靶向特定细胞，这将极大地丰富治疗各类疾病患者的手段。

参考文献：

Rosenfeld, Lior & Sananes, Amiram & Zur, Yuval & Cohen, Shira & dhara, kalyan & Gelkop, Sigal & Ben-Zeev, Efrat & Shahar, Anat & Lobel, Leslie & Akabayov, Barak & Arbely, Eyal & Papo, Niv. (2020). Nanobodies Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen for the Imaging and Therapy of Prostate Cancer. Journal of Medicinal Chemistry. XXXX. 10.1021/acs.jmedchem.0c00418.

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