一个T细胞多个肿瘤靶点：单个TCR靶向多种肿瘤相关抗原

T细胞免疫疗法已经彻底改变了许多类型癌症的治疗方法；然而，其中一些疗法的确切机制仍不清楚。英国卡迪夫大学医学院免疫学教授Andrew K. Sewell课题组发表在《细胞》上的一项研究中，研究发现，在一名成功接受免疫治疗的黑色素瘤患者中，T细胞可以识别3种肿瘤相关抗原，而不是1种：成功免疫治疗的单个T细胞识别多种癌症类型；单个T细胞同时识别多种不同的肿瘤相关抗原；与单特异性TCR相比，“多管齐下”的TCR显示出更好的癌症识别能力；并且开发的pipeline可识别这些“orphan”T细胞识别的新表位。

在TIL治疗后，免疫系统的T细胞可以靶向肿瘤和清除实体肿瘤。使用组合肽库和蛋白质组数据库来揭示成功的TIL治疗IV期恶性黑色素瘤后持续性肿瘤特异性T细胞受体(TCR)的抗原特异性。发现，单个TCR可以通过分别来自Melan A、BST2和IMP2的HLA-A*02:01限制性表位EAAGIGILTV、LLLGIGILVL和NLSALGIFST来靶向多种不同的肿瘤类型。与这三种抗原结合的TCR的原子结构揭示了共有的x-x-x-A/G-I/L-G-I-x-x-x识别基序的重要性。多表位靶向允许单个T细胞同时以几种方式攻击癌症。与传统的T细胞对单个表位的识别相比，这种多管齐下的T细胞对癌细胞的识别能力更强，使它们成为未来免疫疗法发展的有吸引力的候选者。

肿瘤细胞通常有突变的(新抗原)或异常表达的蛋白质（肿瘤相关抗原，TAAs）。抗原呈递是体内每个有核细胞在HLA的背景下向免疫系统递送其小样本蛋白质的过程(图2a)。一旦加载，多肽-HLA复合物呈现在细胞表面，T细胞可以识别它，用于免疫监视来自细胞内病原体、新抗原或TAAs的异常多肽。每个T细胞克隆都有一个独特的TCR，可以识别独特的多肽-HLA复合物。据估计，在成人体内，在循环中有数亿个独特的T细胞克隆。这种令人难以置信的TCR多样性使T细胞能够识别大量的多肽-HLA复合物。杀伤或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以通过其TCR识别靶细胞。这种相互作用通常会导致靶细胞的凋亡(图2b)。

图2 Andrew K. Sewell教授团队的主要发现的示意图。a，抗原呈递概述。蛋白质被蛋白酶体降解成小肽，然后被加载到HLA蛋白中。一旦加载，HLA可以离开内质网并呈现在细胞表面。b，CTL细胞通过其TCR识别来自异常蛋白质的多肽，从而杀死靶细胞。c，TIL治疗程序。肿瘤被手术切除，T细胞在注入患者之前被分离、激活和体外扩增，通常是在淋巴耗竭的化疗之后，并与皮下注射IL-2联合使用。d，像MEL8这样的T细胞克隆表达一个TCR，可以识别来自3个不同TAA的3个肽，增强T细胞识别和肿瘤细胞破坏。

在某些实体瘤中，可在肿瘤微环境中发现T细胞。其中一些T细胞有识别新抗原或TAA的TCR。这些肿瘤特异性T细胞通常数量较少和/或受到免疫抑制肿瘤微环境的抑制。TIL治疗是一种免疫疗法，从肿瘤中分离免疫细胞，然后在体外激活和扩增。扩增后，这些细胞被注入患者体内，在那里它们发现并杀死肿瘤细胞(图2c)。这种类型的免疫疗法在一些患者中显示了有希望的结果，目前正在进行临床试验，以实现这一程序的潜在商业化。确定TIL所识别的抗原的特征，特别是在经历持久缓解的患者中，可能有助于进一步开发这些疗法。该团队研究了来自MM909.24的T细胞，MM909.24是一名IV期黑色素瘤患者，经过成功的TIL免疫治疗，并且十年来一直没有癌症。来自该患者的扩增的TIL细胞中有50%能够在体外杀伤患者的黑色素瘤细胞系。这些T细胞也能够识别和杀伤其他黑色素瘤细胞系，以TCR-HLA依赖的方式。从MM909.24的TIL产物中分离到一个T细胞克隆，标记为MEL8。MEL8 T细胞对黑色素瘤和非黑色素瘤细胞的杀伤作用依赖于TCR-HLA。有趣的是，MEL8 TCR识别一种来自广泛表达于皮肤黑色素瘤的Melan A蛋白的多肽。抗肿瘤活性的广度令人惊讶，因为非黑色素瘤细胞株不表达Melan A蛋白。当Melan A基因在黑色素瘤细胞系中被敲除时，MEL8 T细胞仍然能够杀死肿瘤细胞。总之，这些实验表明，MEL8 TCR还可以识别其他TAA。

为了确定MEL8 TCR可以识别的其他多肽，该团队建立了一个人类TAA多肽数据库。利用这个数据库，MEL8 TCR识别了前10个预测多肽中的3个，这些多肽来自3个不同的TAA：Melan A、骨髓基质细胞抗原2（BST2）和胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（IMP2）(图1d)。虽然TCR的交叉反应之前已经得到证实，但它从未在不同的TAA上显示过。当所有三个TAA多肽都被呈递时，它们对MEL8 T细胞的激活具有相加的效应。最重要的是，当Melan A和BST2基因被敲除，只剩下IMP2时，MEL8 T细胞仍然能够杀死肿瘤细胞。这一点特别重要，因为抗原丢失是肿瘤细胞常用的免疫逃避策略。

图3 MEL8 TCR序列。(A) 显示V(D)J配对的TCRα和TCRβ基因的天然核苷酸序列。(B) 在大肠杆菌中制造的细菌表达的蛋白序列，并经重新折叠后制成可溶性MEL8 TCR，用于生物物理和结构研究。序列包括非天然半胱氨酸残基，如粗体下划线红色所示，以在TCRα和TCRβ恒定区之间形成非天然二硫键。TCRβ链中有助于重新折叠的另外两个替代以粗体。包括Cys到Ala的取代，以消除不正确的二硫键结合形成的可能性。

图4 多管齐下的TCR和表位的结构剖析。

图5 MEL8和MEL5 TCR对配体的识别，以及缺乏对BST2肽的9-mer的多管齐下TCR的识别。MEL5 TCR：之前发表的HLA-A*02:01-Melan A TCR。

为了测试普通人群中是否有能够识别多个TAA的T细胞克隆，从健康个体中分离出免疫细胞。然后用一次只负载一种TAA多肽的HLA刺激T细胞，持续4周。这些受刺激的T细胞能够与所有三种TAA结合，尽管仅用一种TAA刺激。这表明大多数人有能力针对多个TAAs产生免疫反应。

图6 健康供体T细胞的三种肽诱导的T细胞特异性检测设置、用于TCR克隆分型的TIL MM909.24 的四聚体分选以及多管齐下T细胞的潜在益处。(D)同一细胞上多个表位的识别将多管齐下的T细胞识别与常规T细胞交叉反应区分开来，例如在分子模仿诱导的自身免疫病触发期间，T细胞对不同靶细胞上的不同表位做出反应。(E)多管齐下的T细胞识别有许多潜在的优势，除了这样一个事实，即这种T细胞可以更有效地做出反应，因为它们在目标细胞表面“看到”更高密度的抗原。例如，通过失去多肽抗原来逃脱多管齐下的T细胞将更加困难。

TAA具有正常的蛋白质序列，但表达水平异常。这意味着TAA可以在肿瘤细胞中高表达，但在正常细胞中也可以低水平表达。这就提出了一个问题：靶向TAAs是否是一个好的策略，因为存在潜在的off-target脱靶效应，正常的健康细胞可以被CTL细胞杀死。MM909.24患者输注含有MEL8 T细胞的数十亿TIL细胞。即使在完全缓解后，MEL8 T细胞仍留在血液中，但没有组织损伤的病理迹象报道。这可能表明靶向多个TAA靶点是安全的，但需要更多的研究和更大的患者样本。该团队的工作首次表明，单个TCR可以识别多个TAA。这是特别有用的，因为能够识别多个TAA具有成瘾效应，并可能限制肿瘤逃逸。因此，这些发现具有重要的转化意义，例如在TCR转基因T细胞的开发中。

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