ELISA 技术如何适应快速发展的药物发现领域？

     自 50 年前被发现以来，酶联免疫吸附试验 (ELISA) 已成为诊断和药物评价研究的金标准。ELISA 通过将抗原固定在微孔板上，特定抗体结合抗原，并高灵敏度检测特定结合，从而定量感兴趣的分子(例如，蛋白质，肽或激素)。尽管出现了其他方法如流式细胞术，但由于 ELISA 高特异性和多功能性，该技术仍然倍受欢迎。

     近日三位科学家讨论了是什么让 ELISA 技术脱颖而出，以及它如何适应快速发展的药物发现领域。

     Ana Miletic 博士是 Kyowa Kirin 的高级科学家。在华盛顿大学获得免疫学博士学位期间，她专注于免疫细胞信号转导和发育，并在桑福德伯纳姆普雷比斯医学发现研究所完成了博士后研究。她曾在 eBioscience 和 Becton, Dickinson 以及  Company (BD) 从事单克隆抗体研究，六年前加入 Kyowa Kirin，担任早期药物发现项目负责人。

     Anna Dey，约翰·霍普金斯大学生物技术硕士，从事生物技术工作 17 年，主要在癌症研究实验室工作。她是 Kyowa Kirin 的高级研究员，致力于自身免疫性疾病的抗体治疗。

     Cathy Olsen 博士在 Molecular Devices 担任高级应用科学家，并参与了基于微孔板检测系统的广泛应用开发，包括基于细胞的生化和成像分析。她拥有加州大学戴维斯分校细胞与发育生物学博士学位。

ELISA 在药物发现和开发中的应用

01抗细胞因子治疗性抗体的疗效

     对于 Kyowa Kirin 来说，ELISA 是评估抗炎症细胞因子治疗性抗体疗效的关键检查点。通过测定细胞因子的水平，如干扰素 - γ、IL-8 和 tnf - α， Dey 和她的同事们评估了他们的抗体克隆阻止这些细胞因子产生的能力，这有助于他们选择更有效的抗体克隆。

02评估治疗性抗体的药代动力学特性

     借助 ELISA 技术，Miletic 和 Dey 可以评估治疗性抗体的药代动力学特性。在这些研究中，研究小组在不同的时间点测量患者血液中抗体的存在。这个过程帮助他们确定治疗药物的半衰期，这些信息指导他们选择更稳定的抗体克隆。

03评估敲除细胞中 p53 水平的降低

     Molecular Devices 已经证明了各种 ELISA 在广泛的研究方法中的价值，包括 CRISPR 敲除实验。例如敲除 p53 基因，该基因编码肿瘤抑制因子。使用 ELISA 来评估敲除细胞中 p53 水平的降低，证明了该方法在了解基因功能方面的有效性，这可能最终推动新型靶向治疗的发展。

ELISA 检测与其他免疫检测相比的优势

     上述三个例子证明了 ELISA 的多功能性，但其他因素将其与其他免疫测定法区分开来。

     Cathy Olsen 强调了 ELISA 的灵活性和灵敏度：“ ELISA 具有非常高的灵敏度和特异性。根据需要，它们通常具有不同的读数。使用吸光度检测作为读数的比色 ELISA 已经有 30 年的历史了。不过，也有荧光和发光检测，具有更好的灵敏度和更好的动态范围。由于灵敏度高，ELISA 可以检测样品中的低丰度分子。”

     对于 Ana Miletic 来说，特异性是 ELISA 的一个关键属性，这使得它们能够区分密切相关的蛋白质。也就是说，抗体的选择是关键。“酶联免疫吸附试验的效果取决于其中使用的抗体。任何 ELISA 检测的基础都是使用特定的、高亲和力的抗体来检测感兴趣的目标。”换句话说，正确的抗体选择有助于确保目标分析物被检测到，并最大限度地减少与类似分子交叉反应的风险。

     ELISA 的另一个优点是它的简便性，只需要微孔板，移液器和酶标仪(可以添加洗板机以减轻工作量)。尽管它们的设计要求不高，但 ELISA 可以提供多种检测。更重要的是，由于大多数设备都是自动化的，因此可以使 ELISA 更容易实现简化。

ELISA 仪器和自动化工作流程解决方案

     自动化 ELISA 工作流程包括对人工操作的几次升级，但自动化的程度最终取决于通量需求。

     自动液体工作站对于样品制备和试剂添加非常有用，而机械臂可以处理系统不同部分之间的板转移。这样组合就意味着研究人员不必手动移液或将板从工作台搬运到液体工作站，返回到洗板机和酶标仪。由于液体工作站和机械臂可以处理这些步骤，研究人员就有更多的时间来进行更集中的实验。

     另外两个组件使工作流更加流畅，其中之一是自动化调度软件，它协调工作流程的时间线和顺序，以获得更及时、准确的结果。基于细胞的分析需要一个稳定的细胞环境(例如 37℃，5% CO2)，我们使用自动化培养箱来保持一致的条件。

     尽管如此，Cathy Olsen 认为酶标仪是自动化 ELISA 成功的关键。“结果的质量在很大程度上取决于准确检测 ELISA 板中的信号。当分析你的数据时，你想要得到准确的结果和目标蛋白的定量。”酶标仪的软件可以使用内置分析模板提供自动分析。

     总之，自动化 ELISA 工作流程有 2 方面的好处，首先，如前所述，自由时间显著增加，使研究人员能够同时处理多项任务。更重要的是，均匀的样品制备和良好的监测液体处理程序可以减少人为误差。

ELISA  的未来发展

     许多科学家仍继续使用 ELISA 技术，目前的市场分析报告预测，全球研究 ELISA 市场将从 2022 年的 5.194 亿美元增长到 2030 年的  7.5438 亿美元。

     ELISA 继续作为检测体液中特定抗原的诊断基准，医疗保健专业人员在各个领域使用它们，包括艾滋病毒检测、妊娠试验和传染病检测。

     在最近的 COVID-19 大流行中，ELISA 通过检测针对刺突蛋白、核衣壳抗原和其他病毒蛋白的抗体，在扩大我们对所涉及疾病机制的理解方面发挥了重要作用。通过测定疫苗接种后产生的抗体，研究人员还可以评估疫苗的潜在功效并优化其配方。

     SARS-CoV-2 IgG ELISA (间接 ELISA)。SARS-CoV-2 IgG ELISA 示意图。微孔板的底部包被 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白或 Spiker-s1 受体结合域(抗原)，如果在血清样品中存在，抗原特异性的 IgG 结合到包被的孔上，并且结合抗体可以通过添加底物来检测结合的 IgG。

     SARS-CoV-2 核衣壳 IgG ELISA 试剂盒校准曲线。曲线在 SoftMax Pro 软件中绘制，采用四参数 logistic 曲线拟合。根据该曲线，对结果进行了半定量计算

     ELISA 还可以帮助阐明药物的作用机制。即使有靶蛋白存在，也需要研究靶向特定蛋白是如何起作用的。通过将一种药物分子引入不同的细胞类型，并量化这些细胞中目标蛋白的水平，研究人员可以推断出药物对各种细胞过程的影响。

     未来的工作必须侧重于解决 ELISA 的一些局限性以扩大其潜力。一个关键点就是提高灵敏度，以准确地检测样品中的低水平抗原，这可以通过信号放大技术实现。此外，优化阻断剂可以减少背景噪声，防止非特异性抗体结合或与类似抗原的交叉反应。最后，增加多路复用是一种升级，可以同时定量样品中的多种蛋白质，肽和小分子。