临床经验：分化型甲状腺癌何时做NGS基因检测？到底有多大用处

肿瘤基因分型对于优化晚期分化型甲状腺癌（DTC）患者的临床管理至关重要。然而，其在临床实践中的实施尚不明确。为了更好地明确肿瘤基因分型如何以及何时可以辅助临床决策，研究者报告了基于二代测序技术（NGS）对DTC进行分子检测的单中心经验。研究回顾性收集了2008-2022年在IRCSS Sant’orsola-malpigi医院接受分子谱分析的所有晚期DTC成人患者的数据。基因变异与放射性碘难治性（RAI-R）、RAI摄取/疾病状态和至RAI耐药（TTRR）发生的时间相关。

结果显示，RAI-R发生与基因变异之间存在显著相关性（P=0.0001）。约48.7%的RAI-R病例为TERT/TP53突变阳性（包括单一事件和与其他驱动基因变异共突变，如BRAF突变、RAS突变或基因融合），而绝大多数RAI敏感病例携带基因融合（41.9%）或为野生型（WT；41.9%）。RAI摄取/疾病状态和至TTRR的时间与基因变异显著相关（P=0.0001）。特别是，与其他分子亚型相比，以TERT/TP53突变为单一事件或与其他驱动基因共突变的DTC患者显示出更短的中位TTRR，为35.4个月（范围：15.0-55.8个月）。Cox多变量分析显示，TERT/TP53突变作为单一事件或与其他驱动基因共突变仍与RAI-R独立相关（HR 4.14，95%CI 1.51-11.32；P=0.006）。应将基因变异的常规检测作为临床检查的一部分，以识别侵袭性更强的肿瘤子集和携带可干预的基因融合的肿瘤子集，从而确保所有晚期DTC患者得到适当的治疗。

晚期DTC的RAI耐药和至RAI-R发生的时间与基因谱显著相关；

基因检测可以识别更具侵袭性的晚期DTC子集和那些有可作为治疗靶点的基因融合；

基因检测应作为临床检查的一部分，对所有晚期DTC患者应尽早进行基因检测。

研究背景

近年来，人们对分化型甲状腺癌（DTC）的生物学背景进行了深入研究，发现了具有显著基因型-组织学表型相关性的分子变异，并对临床实践产生了相关影响。众所周知，大多数DTCs的特征是相互排斥的驱动事件，要么是点突变，要么是基因重排，涉及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路。特别是，BRAF（60%）、NRAS（4%）、HRAS（1.5%）和KRAS（0.3%）基因的非重叠突变见于传统甲状腺乳头状癌（PTC），即生长形成乳头状的PTC，包括经典和高细胞亚型。

基因重排，包括RET(8%)、BRAF(2%)、NTRK1/3(2%)、ALK(1%)、FGFR2(0.3%)和LTK(0.3%)，发生于一小部分传统PTCs。相反，H/K/NRAS突变(40%)，更罕见的DICER1(7%)、EIF1AX(5%)、EZH1(7%)、SPOP(3%)、IDH1(1%)和SOS1(1%)，以及PAX8/PPARG重排发现于滤泡性癌，如滤泡性甲状腺癌（FTC）和包裹性滤泡性变异型乳头状癌。TERT启动子突变在PTCs和 FTCs中的发生率分别为12%和18%，在许多研究中已被证明具有不良预后意义。

这些进展导致了放射性碘难治性（RAI-R）DTC治疗模式的转变，多种酪氨酸激酶抑制剂正成为RAI-R DTC的标准治疗。

最近NTRK和RET抑制剂的出现进一步扩大了RAI-R DTC的治疗选择，这些抑制剂在NTRK或RET基因融合阳性的转移性/晚期RAI-R DTC患者中显示出显著和持久的缓解。

毫无疑问，在这种情况下，肿瘤基因分型对于优化晚期DTC患者的临床管理变得至关重要。然而，其在临床实践中的实施仍有争议，并且使用时机和算法的详细建议仍未明确。研究者在此报告了其对晚期DTC患者进行分子检测的单中心经验，目的是更好地确定肿瘤基因分型如何以及何时可以帮助临床决策。

研究结果

患者的特征和基因变异：

回顾性研究共纳入了82例连续的转移性/晚期DTC成年患者。中位诊断年龄为47岁（范围20-86岁），女性占65.9%。73.2%的肿瘤组织学类型为PTC，包括根据当前分类具有BRAF p.V600E样分子谱的浸润性滤泡型PTC，包裹性滤泡变异型PTC占7.3%，FTC占13.4%，滤泡细胞嗜酸细胞性甲状腺癌（OCC）占6.1%。

在诊断时，53.7%的病例表现为甲状腺内多灶性病变，19.5%的病例已发生远处转移。

对原发灶、淋巴结转移灶和远处转移灶进行分子检测的比例分别为86.6%、9.8%和3.7%。研究在89%的病例中分析了组织学标本，在11%的病例中分析了细胞学标本。33例（40.2%）检测到至少1种DNA突变，25例（30.5%）检测到基因融合阳性，其中1例RET-CCDC6阳性，同时携带PIK3CA、TP53和TERT突变。其余24例（29.3%）均为野生型（WT）。

突变组中，BRAF p.V600E突变16例（19.5%），RAS突变9例（11%）（NRAS，n=4；HRAS，n=3；KRAS，n=2例）。BRAF p.V600E和RAS突变分别为10例和3例患者的单一事件。1例患者发生HRAS突变与PAX8-PPARG融合。在17例病例 (20.7%) 中发现了TERT启动子的替换，并且在11份肿瘤样本中这些替换以共突变形式发生。其他较少见的突变包括TP53（4例，4.9%，其中2例为单一事件）、PIK3CA（1例共突变，1.2%）、AKT1（1例共突变，1.2%）和RNF43（1例共突变，1.2%）。在基因融合阳性亚组中，NTRK1和NTRK3重排最常见，见于14例（17.1%）患者，其次是RET和ALK重排，分别见于9例（11.0%）和2例（2.4%）患者（图1）。在1例患者中，同时携带RET融合与PIK3CA、TP53和TERT突变。

图1

根据基因变异进行临床病理特征分析：

首先，病例被分为三个主要亚组：突变阳性DTC、融合阳性DTC和WT-DTC。根据分子事件类型（BRAF突变、RAS突变、TERT/TP53突变为单事件、基因融合）对突变阳性DTC和融合阳性DTC病例进行了分层。各分子亚组的主要临床病理特征见表1。

表1

BRAF突变型、RAS突变型、TERT/TP53突变型、所有融合阳性与野生型DTC的主要临床病理变量比较显示，性别差异无统计学意义（P=0.62），中位年龄差异有统计学意义（P=0.0001）。特别是基因融合阳性的DTC与年轻患者相关。正如预期的那样，肿瘤组织学与基因变异之间存在统计学相关性（P=0.001）。值得注意的是，BRAF基因突变仅存在于传统PTC中（100%），而RAS基因突变率在FTC（77.8%）和OCC（11.1%）中较高。1例实性/小梁变异PTC伴PAX8-PPARG重排患者存在RAS共突变。基因重排仅在PTC中发现。N分期与基因变异有统计学相关性（P=0.0001）：突变阳性DTC和融合阳性DTC分别在45.4%和68.0%的病例中为N阳性。

M分期、放射性碘摄取/疾病状态，以及根据基因变异达到放射性碘摄取难治状态的时间：

假设TERT/TP53突变（无论是单一事件，还是与BRAF或RAS共突变）具有负预后价值，研究将病例分层为5个分子亚组：（i）BRAF突变DTC作为单一事件；（ii）RAS突变DTC作为单一事件；（iii）TERT/TP53突变DTC作为单一事件，或与其他驱动基因变异（BRAF突变、RAS突变或基因融合）共突变；（iv）基因融合作为单一事件；(v) WT（无上述任何变异）。

正如预期的那样，M分期和基因变异之间存在统计学相关性（P=0.0001）。特别是，75%的转移性病例在诊断时为TERT/TP53突变阳性，包括单一事件和合并其他驱动基因变异，而大多数局部病例为WT（34.8%）和融合阳性（34.8%；表2；图2A）。

表2

图2

为了更好地确定肿瘤基因分型在DTC患者临床管理中的临床作用，研究评估了RAI摄取/疾病状态和基因变异之间的相关性。中位随访66个月（范围：12-301个月），39例（47.6%）患者发生RAI-R。根据RAI摄取/疾病状态，35例（42.7%）为RAI敏感且疾病缓解（RAI+/D-），8例（9.8%）为RAI敏感且疾病持续（RAI+/D+），19例（23.2%）为RAI耐药且疾病持续（RAI-/D+），20例（24.4%）为RAI耐药且疾病进展（RAI-/PD；表2）。其中，16例（19.5%）患者一线使用仑伐替尼治疗，1例（1.2%）一线使用索拉非尼治疗后再使用仑伐替尼治疗。值得注意的是，根据患者肿瘤的分子谱，2例患者（2.4%）接受了索拉非尼、仑伐替尼和NTRK抑制剂治疗，1例患者（1.2%）接受了仑伐替尼作为一线治疗，之后接受了RET抑制剂治疗。

RAI-R发生与基因变异之间存在显著相关性（P=0.0001）。事实上，48.7%的RAI-R病例为单一事件的TERT/TP53突变阳性，或者伴随其他驱动基因变异（BRAF突变、RAS突变或基因融合）共突变，而绝大多数RAI敏感病例携带基因融合（41.9%）或为WT（41.9%；表2；图2B）。RAI摄取/疾病状态与特定的基因变异亚组有统计学关联（P=0.0001）。在35例RAI+/D-病例中，5例（14.3%）为BRAF p.V600E突变阳性，14例（40.0%）为基因重排阳性（9例NTRK和5例RET），16例（45.7%）为WT。RAI+/D-病例中没有一例携带TERT/TP53突变作为单一事件或与其他驱动基因变异共突变。相反，在20例RAI-/PD中，14例（70.0%）为TERT/TP53突变作为单一事件或与其他驱动基因变异共突变，3例（15.0%）为RAS基因突变，2例（10.0%）为基因融合，仅1例为WT（4.8%；表2；图2C）。

不仅RAI摄取/疾病状态，而且TTRR也与基因变异显著相关（P=0.0001）。尤其是，TERT/TP53突变作为单一事件或与其他驱动基因变异共突变的DTC的中位TTRR为35.4个月（15.0-55.8个月），短于融合阳性DTC的100.4个月（73.7-127.1个月）和WT DTC的112.2个月（83.6-140.7个月；图3）。

图3

为了评估基因变异对RAI-R发生的预测价值是否独立于其他已知的临床病理因素，研究进行了单变量和多变量Cox比例风险回归分析。单因素分析显示，T3-T4期〔风险比（HR）4.45，95%CI 2.09-9.47；P=0.0001〕、仅存在RAS突变（HR 4.83，95%CI 1.29-18.09；P=0.01）、以及TERT/TP53突变作为单一事件或与其他驱动基因变异共突变（HR 5.98，95%CI 2.22-16.13；P=0.0001）与RAI-R的发生显著相关。多因素分析显示，T3-T4期（HR 3.82，95%CI 1.69-8.63；P=0.001）和TERT/TP53突变作为单一事件或与其他驱动基因变异共突变（HR 4.14，95%CI 1.51-11.32；P=0.006）与RAI-R独立相关。

讨 论

在过去的几十年里，分子检测在甲状腺结节术前细针穿刺诊断的辅助手段、风险分层以及最近预测分子靶向治疗的疗效方面发挥了越来越重要的作用。DTC的主要基因变异是NRAS、HRAS、KRAS、BRAF、PTEN、EIF1AX、DICER1、PIK3CA、TERT、TP53和RET突变，以及PAX8/PPARG、ALK、NTRK1和NTRK3重排。它们可分为两大类：促进肿瘤发生的驱动变异，以及叠加在促进高级别肿瘤和未分化癌进展的驱动事件之上的继发性变异。这些继发性变异包括TERT启动子、PIK3CA/AKT/PTEN通路基因和TP53突变。尤其是，BRAF和TERT启动子突变同时存在与具有侵袭性临床病理特征、远处转移风险增加和预后不良的DTC亚组相关。因此，强烈建议将TERT启动子突变分析纳入常规临床病理评估，以便进行准确的风险分层。TP53突变以及PIK3CA/AKT/PTEN通路基因突变代表了肿瘤侵袭性的额外继发性基因标志物。事实上，在10%-35%的低分化甲状腺肿瘤中检测到TP53变异，在未分化甲状腺癌中高达80%，而在传统的DTC中通常未检测到TP53突变。

在过去几年中，分子谱分析变得更加重要，因为NTRK和RET重排已被认为是转移性RAI-R-DTC的可干预靶点，这不可避免地扩大了需要寻找的基因变异谱。

综合考虑所有这些因素，DTC的分子检测现在具有很大的临床意义，因为它不仅可以识别高危病例，而且可以在这些高危病例中识别那些可干预的基因变异的患者。因此，定制患者的积极监测和系统性治疗变得至关重要。然而，迄今为止，在临床实践中使用分子检测的时间和规则仍未达成共识。

本文报告了82例晚期DTC患者的分子检测结果，探讨了分子检测数据的临床意义，强调了肿瘤基因分型对DTC患者管理的相关性，并分享了临床实践的模式。

NGS在近一半的病例中发现了至少一种DNA突变，在约1/3的病例中发现了基因重排，这证实了DTC代表了一组异质性肿瘤，而非单一实体，具有不同的病理特征、分子背景和临床行为。因此，本研究数据证实了肿瘤基因型、组织学表型和临床病理特征之间存在严格的相关性。事实上，在突变阳性的DTCs中，BRAF V600E突变被证实几乎仅限于传统的PTC，而RAS突变通常属于FTC和OCC组织类型。在融合阳性的DTCs中，NTRK1-3、RET和ALK重排仅限于PTC和浸润滤泡型PTC组织类型。

首先，与文献中已经报道的一致，研究证实TERT启动子、TP53和PIK3CA突变与侵袭性DTC相关，包括发生远处转移和较早发生RAI-R。事实上，在本病例系列中，50%的RAI-R病例是TERT/TP53突变作为单一事件或与其他驱动基因变异（BRAF突变、RAS突变或基因融合）共突变，并且在这一分子亚组中，TTRR显著短于其他亚组，这证实了TERT启动子突变影响RAI亲和力。值得注意的是，TERT启动子、TP53和PIK3CA突变的存在（无论是单一事件还是共突变）与RAI-R的发生显著相关，独立于其他已知的病理参数。因此，本数据表明，晚期DTC的前期肿瘤基因分型应至少包括TERT和TP53，以识别那些在疾病持续或复发时可以考虑早期全身治疗的高危患者。

其次，根据本研究数据，对DTC中常见重排基因进行的分子分析使研究者在约三分之一的病例中发现了融合事件。众所周知，融合阳性DTCs包含一个特殊的患者亚群，具有特定的临床病理特征，如较年轻的发病年龄、PTC形态以及多结节生长、瘤内纤维化和广泛淋巴血管侵犯三联征。在本研究的病例中，融合阳性DTC的中位诊断年龄为41岁，NTRK1和NTRK3融合病例的中位诊断年龄略低。N1a和N1b的淋巴结转移率分别为24%和44%。在基因融合病例中，超过一半是多灶性的。总体而言，融合阳性病例预后较好。Cox比例风险回归分析显示，基因重排的存在与RAI-R的发生无关。然而，6例基因融合肿瘤患者在最初诊断后20个月内转变为RAI-R。其中2例（均为NTRK重排进展性疾病）接受了NTRK抑制剂治疗。另外1例携带RET重排伴TERT启动子和TP53突变，并且就诊时疾病晚期，接受了RET抑制剂治疗。因此，应常规推荐所有晚期DTC患者进行包括基因融合在内的分子检测，因为早期识别可作为治疗靶点的基因变异可以为这些患者提供适当的分子驱动治疗。然而，与单核苷酸变异和小插入-缺失相比，基因融合更麻烦（例如，它们通常需要更高的肿瘤细胞富集以可靠地进行鉴定），并且检测费用昂贵。因此，由于它们与其他更容易检测的驱动变异相互排斥，因此首先检测所有高级DTC的SNP和小的插入-缺失，然后检测阴性病例的基因融合是非常合理且符合成本效益的。

虽然本研究结果可能为基因检测在DTC患者管理中的临床相关性提供重要信息，但研究者承认研究存在一些局限性。本研究采用的回顾性设计（纳入了更侵袭性的DTC子集）可能在解读结果时存在较大偏倚。因此，需要在更大的病例系列中进行前瞻性验证，以更好地确定分子检测在DTC预后中的作用。

这些数据证实了对于所有晚期DTC患者，通过全面的NGS和两步法进行基因检测的临床意义，从而确定侵袭性更强的肿瘤子集和携带可作为治疗靶点的基因融合的肿瘤子集。因此，基因检测应作为临床检查的一部分，并尽早对所有晚期DTC患者进行基因检测，以确保其获得最合适的治疗。

参考文献：Nannini, M et al. “Clinical relevance of gene mutations and rearrangements in advanced differentiated thyroid cancer.” ESMO open, vol. 8,6 102039. 23 Oct. 2023, doi:10.1016/j.esmoop.2023.102039

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