指导转移性尿路上皮癌精准治疗，血液ctDNA-NGS检测靠谱

在转移性尿路上皮癌（mUC）中，鉴于最近发现的可靶向变异，基因检测可能有助于改善患者的管理。然而，组织样本的采集仍然具有挑战性。本研究评估了血浆循环肿瘤 DNA（ctDNA）测序在这些患者中的临床效用。STING 试验（NCT04932525）前瞻性入组了 mUC 患者，使用 Foundation One Liquid CDx Assay（324 个基因、血液肿瘤突变负荷 [bTMB]、微卫星不稳定性状态）对 ctDNA 进行分析。每份基因检测报告都由多学科肿瘤委员会（MTB）审查。2021 年 1 月至 2022 年 6 月，140 例 mUC 患者接受了分子检测。获得检测结果的中位时间为20天（CI（置信区间）95%：[20，21]）。ctDNA分析再现了先前组织队列的体细胞基因图谱。连续ctDNA样本的一致性较强（r = 0.843 CI95%：[0.631–0.938]，p < 0.001）。63 例患者（45%）检测到至少一个可操作靶点，共有 35 个可操作变异，包括高 bTMB（≥10 muts/Mb）（N = 39，21.1%）、FGFR3变异（N = 20，10.8%）和同源重组缺陷（HRD）相关基因变异（N = 14，7.6%）。MTB 向所有这 63 例患者（45.0%）推荐了匹配治疗。其中，8例患者（5.7%）接受了匹配治疗，客观缓解率为50%（CI95%：15.70-84.30），中位无进展生存期（PFS）为5.2个月（CI95%：4.1-NR）。在接受免疫治疗的患者中，FGFR3 变异与较短的 PFS 相关。本研究表明，mUC进行ctDNA检测是及时开始匹配精准治疗的可靠且可行的方法。

研究背景

膀胱尿路上皮癌是全球第十大最常见的癌症。在尿路上皮癌中，膀胱尿路上皮癌占90%-95%，上尿路（肾盂、输尿管）尿路上皮癌占5%-10%。关于组织学亚型，尿路上皮癌占90%，其他少见的组织学亚型包括鳞状细胞癌、腺癌和神经内分泌癌。初诊时，25%的患者为局部晚期肌层浸润性膀胱癌（MIBC）或转移性尿路上皮癌（mUC）。

尽管一线标准治疗仍然是含铂化疗方案，但在过去十年中，mUC的治疗格局发生了变化。免疫检查点抑制剂（ICI）可用于程序性死亡配体1阳性（阿替利珠单抗）和不适合含铂化疗（帕博利珠单抗）的患者。对于含铂化疗后疾病未进展的患者，推荐ICI（阿维鲁单抗）维持治疗。对于疾病进展的患者，帕博利珠单抗可作为二线治疗。靶向Nectin-4的抗体-药物偶联物（ADC）enfortumab vedotin在三线治疗中显示出较优的总生存期（OS）。在既往接受过含铂化疗和免疫治疗的患者中，FGFR抑制剂厄达替尼对FGFR2/3突变或融合患者有效。

尿路上皮癌（UC）的体细胞突变发生率高于其他实体瘤，除FGFR外，还有其他潜在可靶向变异。在MIBC中，发现了高频基因变异，包括DNA修复、表观遗传和细胞周期调控以及RTK/RAS/PI3K通路。此外，分子标志物可指导治疗。考虑到这些应用，每个患者都可能获益于基因检测，接受FGFR抑制剂治疗，或至少入组靶向治疗临床试验。

然而，肿瘤组织可能难以获取，转移灶活检并不总是可行的。在癌症患者（包括UC）的血浆中可以检测到循环肿瘤（ct）-DNA。然而，关于ctDNA在转移性UC日常管理中的临床价值，可及数据有限。本研究对前瞻性mUC患者队列进行了ctDNA分析，旨在评估基于血液的分子检测在mUC日常实践中的临床效用。

研究结果

患者基线特征

2021 年 1 月至 2022 年 6 月期间，140 例 mUC 患者入组了液体活检 STING 试验（图 1）。130 例患者（92.9%）检测成功（有足够的 DNA 进行检测）。表 1A 和 1B 分别总结了患者诊断和入组时的人口统计学和临床基线特征。男性占 75.7%。大多数患者为 UC（n = 133，95%）。约三分之二的患者为膀胱癌。入组时的中位转移部位数量为 2（范围：0-6），87 例（62.1%）患者有内脏转移（即骨转移、肝转移或肺转移）。近三分之一的患者（30.7%）在液体活检前未接受过全身治疗。转移性疾病的治疗详情列于表1B。

图1. 研究流程

表1A. 140例患者诊断时的人口统计学和临床基线特征

表1B. 140例患者入组时的人口统计学和临床基线特征

基因突变图谱

在识别的782个变异中，698个（89.3%）是突变，68个（8.7%）是扩增，16个（2.1%）是重排。最常涉及的基因（图2）是TP53（n=74，52.9%的患者）、TERT（n=63，45.0%）、DNMT3A（n=50，35.7%）、ARID1A（n=24，17.1%）、RB1（n=23，16.4%）、FGFR3（n=20，14.3%）、PIK3CA（n=19，13.6%）、ASXL1（n=18，12.9%）、ATM（n=18，12.9%）和KDM6A（n=17，12.1%）。

图2. 每例患者液体活检检出的致病性或可能致病性基因变异热图

中位血液肿瘤突变负荷（bTMB）为 5.1 muts/Mb（范围：0-58.2）。在132例有bTMB结果的患者中，84例（63.6%）bTMB较低（<10 muts/Mb），48例（36.4%）bTMB较高（≥10 muts/Mb）。基于液体活检，没有患者微卫星不稳定。中位肿瘤分数（tumour fraction score，TFS）为 0（范围 0-0.70）。三分之二的患者肿瘤分数为0（n = 89，66.4%）；三分之一的患者肿瘤分数>0（n = 45，33.6%）。排除肿瘤分数为0的患者时，中位肿瘤分数为0.18（范围0.10-0.70）。

MTB推荐的匹配治疗及临床疗效

63 例患者（45%）检测到至少一个可操作靶点，共有 35 个可操作变异，包括 bTMB ≥10 muts/Mb（n = 39，21.1%）、FGFR3变异（n = 20，10.8%）和同源重组缺陷相关基因变异（n = 14，7.6%）（图 3A）。MTB 向所有这 63 例患者推荐了匹配治疗。在所有靶向治疗相关变异中，63个（34.1%）为ESCAT（ESMO分子靶点临床可操作性量表）I，70个（37.8%）为ESCAT IIIA，3个（1.6%）为ESCAT IIIB，49个（26.5%）为ESCAT IV。讨论液体活检结果的中位时间为 20 天（即从获得血液样本的日期到 MTB 讨论临床病例的日期，包括样本管理和测序）。5例患者（3.6%）接受了二次液体活检，4例患者（2.9%）接受了三次活检。

图3. (A) MTB治疗相关变异热图和相应的ESMO分子靶点临床可操作性量表（ESCAT）评级；(B) 接受的匹配精准治疗

总体而言，8 例患者（占 MTB 讨论的所有患者的 5.7%）接受了 MTB 推荐的匹配精准治疗。2 例单独 FGFR 抑制剂（厄达替尼），3 例 FGFR 抑制剂联合 ICI，1 例 HER2 特异性 ADC，2 例 tipifarnib（一种选择性法尼基转移酶抑制剂，针对HRAS突变肿瘤）（图 3B）。ORR为50.0%（CI（置信区间）95%：15.7–84.3）。从开始精准治疗起的中位PFS为5.2个月（CI95%：4.1-NR），中位OS为9.3个月（CI95%：6.6-NR）。关于FGFR抑制剂的ORR，有反应的患者（n=3）的中位FGFR变异丰度为0.35%（范围0.20-0.43%），无反应的患者（n=2）为3.67%（范围0.27-7.07%）。

ctDNA肿瘤分数的预后及预测价值

使用泊松回归，肿瘤分数可预测纳入时的转移数量（风险比（RR）=2.484 CI95%：[1.191–4.941]，p = 0.012）。肿瘤分数与液体活检前接受的治疗线数趋向于相关（RR=2.402 CI95%：[0.959–5.591]，p = 0.051）。逻辑回归显示，肿瘤分数与内脏转移（即骨转移、肝转移或肺转移）无关（OR= 0.626 CI95%[0.282;1.337]，p = 0.236）。

关于入组STING研究起的OS，在单变量分析中，肿瘤分数＞0的患者预后较差（HR=2.468 CI95%：[1.364–4.465]，p = 0.002，图4）。调整内脏转移（即骨、肝或肺转移）、纳入时PS ≥2和活检前接受的治疗线数后，未发现差异（HR=1.977 CI95%：[1.040–3.757]，p = 0.037）。在43 例一线治疗患者中，调整内脏转移和纳入时 PS ≥2 后，肿瘤分数不是预后因素（HR=0.268 CI95%：[0.007–10.632]，p = 0.483）。

图4. 液体活检起的OS，TFS - vs TFS +

液体活检后接受ICI治疗的患者的疗效分析

在液体活检后接受ICI治疗的40例患者中，27例（68.0%）接受帕博利珠单抗治疗，7例（18.0%）接受阿维鲁单抗治疗，4例（10.0%）接受多塔利单抗治疗，1例（2.0%）接受伊匹木单抗治疗。从液体活检到ICI开始的中位时间为2.1个月（范围：0.1-15.3）。中位PFS为2.8个月（CI95%：[2.2–6.9]），中位OS为8.4个月（CI95%：[6.6-NR]）。FGFR3变异与较短的PFS相关（HR=5.048 CI95%：[1.659–15.360]，p = 0.002，图5），与OS无关（HR=1.340 CI95%：[0.746–0.3762]，p = 4.773）。高 bTMB（≥10 muts/Mb）（HR=2.387 CI95%：[0.854–6.671]，p = 0.090）和肿瘤分数＞0（HR=1.934 CI95%：[0.657–5.699]，p = 0.002）与 PFS 无关。

图5. 从开始ICI治疗起的PFS，FGFR3 - vs FGFR3 +

连续液体活检的一致性

比较了 9 例患者在第一次和第二次活检中检出的相同变异的丰度。两次活检的中位时间间隔为5.2个月（CI95%：[2.8-NR]）。log10 转化后使用 Pearson 相关系数，丰度的一致性较强（r = 0.843 CI95%：[0.631–0.938]，p < 0.001）（图 6）。

图6. 连续ctDNA样本一致性散点图

讨论 

本研究报告了ctDNA检测对晚期mUC患者的可行性和临床实用性。这种可重复技术的可及性高于组织活检，使更多患者能够接受检测。

关于mUC分子图谱的研究结果与既往研究一致，参与DNA修复、表观遗传、细胞周期调控或RTK/RAS/PI3K通路的基因突变频率较高。在既往的mUC患者队列中，ctDNA与匹配肿瘤组织的一致性为83.4%。DNMT3A、ASXL1、TET2或ATM等变异被怀疑为克隆性造血突变。ATM变异是潜在的治疗靶点，区分体细胞突变和克隆性造血可能具有挑战性。在我们的队列中，近13%的患者存在ATM突变，其发生率高于或类似于使用组织测序的其他队列。关于ESCAT I变异，FGFR3变异的发生率与组织检测相似；然而，在我们的队列中，没有发现微卫星不稳定性，这与组织活检的结果相反。ctDNA在评估微卫星状态方面可能效用较低。

我们发现，mUC进行血浆ctDNA检测提供了新的靶向治疗可能性。在mUC三线治疗中，紫杉烷类或长春氟宁等单药化疗的ORR为10%，ADC约为30%-40%，厄达替尼（FGFR抑制剂）为40%。因此，在我们的队列中观察到的 50% 的缓解率似乎很有希望，尤其是对于既往接受过多线治疗的患者。在 45% 的患者中检测到可操作靶点，令人鼓舞，提示很大一部分患者可能获益于精准治疗。然而，接受这种治疗的患者比例较低，提示精准治疗在临床实践中的实施可能存在障碍。63 例患者中只有 8 例接受了 MTB 推荐的匹配治疗，这意味着 55 例患者不适合临床试验。需要注意的是，基于特定临床试验筛选时进行的组织活检，几例患者接受了FGFR抑制剂治疗，MTB不认为是靶向治疗相关。这凸显了需要更有效的方法来识别和选择最有可能从靶向治疗中获益的患者，并提高这些疗法的可及性。因此，mUC应从确诊转移性疾病的一开始就进行液体活检，并应尽快开始精准治疗，以改善不良预后。这些数据提示，需要更好地了解UC的生物学，识别更多可成药靶点，开发新的疗法或疗法组合。对1期试验的回顾性分析显示，在泛癌种患者中，与无匹配靶向治疗的患者相比，接受靶向治疗的患者结局更好。MOSCATO-1表明，靶向治疗的PFS 长于先前治疗的PFS。然而，在NCI-MATCH中，只有7/27组显示出疗效，在SHIVA-01中，与医生选择的治疗相比，分子靶向药物没有优势。

ctDNA丰度（通过肿瘤分数估计）因患者、癌症类型和临床分期而异。在我们的队列中，我们观察到 mUC ctDNA 肿瘤分数与转移部位数量相关。这些发现提示，高ctDNA水平与更具侵袭性的疾病有关，与先前研究结果一致。此外，我们发现肿瘤分数＞0与较差的预后相关，但调整已知的预后因素和接受过的治疗线数后，不相关。这些结果可能是因为肿瘤分数＞0的患者在较晚阶段进行了液体活检。对于43例一线接受液体活检的患者，使用整合Bajorin评分的多变量模型时，我们观察到肿瘤分数与OS无关。这一结果可能是由于患者数量少导致功效不足，既往的队列研究显示，在一线治疗中，ctDNA丰度是OS的独立预后因素。

在接受ICI治疗的mUC患者中，FGFR3变异与较短的PFS相关，尽管数据存在争议。bTMB与ICI反应无关，先前帕博利珠单抗治疗mUC的研究也描述了这一结果，可能是由于患者数量有限所致。

在本研究中，连续ctDNA液体活检具有显著的一致性，相同变异的丰度有很强的相关性。尽管存在相互矛盾的数据，我们的结果支持ctDNA在日常实践中是一种可重复的检测方法。然而，ctDNA可能出现假阴性结果或仅报告克隆性造血，这需要基于组织的测序。

本研究的一个局限是缺乏配对的组织活检来验证和比较基于血液的基因检测结果。其他局限包括回顾性设计以及液体活检在不同时间点进行，导致潜在的偏倚。

综上所述，本研究表明，对于mUC，大panel ctDNA检测是及时开始精准治疗的可靠且可行的方法。液体活检技术是微创的，应从确诊转移性疾病一开始就常规整合，为个体化医疗和精准肿瘤学铺平道路。然而，在液体活检未发现肿瘤变异（即假阴性），或检测疑似克隆性造血的潜在可靶向变异（如ATM突变）时，仍然需要基于组织的测序。考虑到基于肿瘤组织和ctDNA的分子检测相辅相成以及获取结果的延迟，患者可常规获益于这两种检测，优化治疗。应在一线治疗大规模前瞻性队列中评估预后生物标志物。

参考文献：

Helal C, Pobel C, Bayle A, Vasseur D, Nicotra C, Blanc-Durand F, Naoun N, Bernard-Tessier A, Patrikidou A, Colomba E, Flippot R, Fuerea A, Auger N, Ngo Camus M, Besse B, Lacroix L, Rouleau E, Ponce S, Italiano A, Loriot Y. Clinical utility of plasma ctDNA sequencing in metastatic urothelial cancer. Eur J Cancer. 2023 Oct 6;195:113368. doi: 10.1016/j.ejca.2023.113368. Epub ahead of print. PMID: 37897866.

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