快报｜外排泵Rv1258c具有激活氧化应激并通过VII分泌系统ESX-3介导结核分枝杆菌铁代谢的新功能

作者：孙宏，盛钢，徐玉辉，褚洪迁，曹廷明，戴广明，田娜，段惠娟，孙照刚

第一作者及单位：孙宏，盛钢，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所；徐玉辉，中国中医科学院中药研究所

通信作者及单位：孙照刚，首都医科大学附属北京胸科医院/北京市结核病胸部肿瘤研究所

Efflux pump Rv1258c activates novel functions of the oxidative stress and via the VII secretion system ESX-3-mediated iron metabolic pathway in Mycobacterium tuberculosis

Hong Sun，Gang Sheng，Yuhui Xu， Hongqian Chu，Tingming Cao，Guangming Dai， Na Tian，Huijuan Duan，Zhaogang Sun.

Microbes Infect，2023 Oct 18: 105239. 

doi: 10.1016/j.micinf.2023.105239. 

研究背景

氧化应激和铁代谢是结核分枝杆菌(MTB)在宿主细胞中存活所必需的。了解结核分枝杆菌的稳态生物学对于控制这种疾病至关重要。结核分枝杆菌的RND和ABC外排泵家族具有获取和释放铁的能力，但MFS外排泵是否也参与铁代谢仍有待进一步探讨。外排泵Rv1258c属于主要促进剂超家族(MFS)，可以主动泵送药物，促进MTB对多种药物产生耐药。之前的研究表明，敲除Rv1258c只下调了五种VII型分泌系统中的一种ESX-3。ESX-3转运蛋白复合物对铁获取至关重要，铁稳态在细菌抵抗氧化应激中起着至关重要的作用。我们推测MFS外排泵Rv1258c可能参与ESX-3介导的铁代谢，同时调节MTB的氧化应激水平。

研究方法

1. Rv1258c缺失影响ESX-3功能：通过qRT-PCR检测Rv1258c缺失菌株中ESX-3系统关键蛋白的表达情况，通过电感耦合等离子体质谱(ICPMS)检测裂解菌液和培养基上清液中的铁浓度。

2. Rv1258c、EccB3、EccD3和PPE4之间的相互作用：通过BKUNYUN超级计算平台，使用AlphaFold2完成蛋白之间相互作用的预测，使用酵母双杂交表达系统来测试Rv1258c与EccB3、EccD3和PPE4之间可能的相互作用。

3. Rv1258c参与MTB氧化代谢：通过TMT标记的定量蛋白质组学分析方法分析H37Rv Rv1258c与WT样品在培养基中的差异表达蛋白（DEPs），分析Rv1258c是否参与氧化应激。测定H37Rv Rv1258c与WT膜电位变化、NAD+/NADH的比值、氧化应激相关蛋白表达，判断Rv1258c是否参与氧化应激。

研究结果

1. Rv1258c的缺失影响了ESX-3调节的铁吸收：采用qRT-PCR检测发现，除EccB3外，EccA3、EccC3、EccD3和EccE3的表达均下调(图1A)。通过电感耦合等离子体质谱(ICPMS)检测裂解菌液和培养基上清液中的铁浓度，与WT相比，H37Rv Rv1258c在培养基中的铁浓度相对较高，而裂解的杆菌上清液中的铁浓度相对较低(图1B)，这表明铁在H37Rv Rv1258c的培养基中有潜在的积累，H37Rv Rv1258c可能损害了铁的摄取。这些结果表明，Rv1258c可能通过调节ESX-3的铁摄取能力来影响结核分枝杆菌的铁代谢。

图1 采用TMT标记的定量蛋白质组学分析方法对H37Rv Rv1258c与WT样品在细胞蛋白中的差异表达进行分析。A: WT和H37Rv Rv1258c中EccA3、EccB3、EccC3、EccD3、EccE3 mRNA的相对表达量; B: 裂解杆菌上清和培养基中的铁浓度

2. Rv1258c、EccB3、EccD3和PPE4蛋白与蛋白之间的相互作用：通过AlphaFold 2软件预测蛋白质之间的相互作用。结果表明，Rv1258c与PPE4和EccD3相互作用较弱，而与EccB3相互作用较弱(图2A)。使用酵母双杂交表达系统来测试Rv1258c与EccB3、EccD3和PPE4之间可能的相互作用。结果表明，Rv1258c与PPE4和EccD3相互作用强，但与EccB3相互作用弱(图2B~D)。

图2 Rv1258c与EccD3和PPE4的相互作用。A: 预测是在BKUNYUN超级计算平台的支持下使用AlphaFold2完成的，使用PyMOL图形分析软件进一步呈现和分析蛋白质结构的图像。蓝色代表EccB3，黄色代表EccD3，红色代表Rv1258c，绿色代表PPE4; B~D: 酵母双杂交系统。1: PBT3-N-Rv1258c和pPR3-N(自激活); 2: pBT3-N-Rv1258c、pPR3-N-Rv0286(实验组); 3: pBT3N-Rv1258c、pPR3-N-Rv0290(实验组); 4: pBT3-N-Rv1258c、pPR3-N-Rv0283(实验组); 5: pBT3-N-Rv1258c和POST NubaI(功能验证); +: pTSU2-APP、pNubG-Fe65(阳性对照组);-: pTSU2-APP、PPR3-N(阴性对照组)。10-1、10-2、10-3、10-4表示酵母杂交实验中对酵母的梯度稀释。DDO (A)、TDO (B)和QDO (C)代表不同的选择性培养基。

3. H37Rv Rv1258c和WT样品培养基中的DEPs证实了Rv1258c参与了MTB的氧化代谢：图3A描绘了H37Rv Rv1258c和WT样品中DEP的火山图。69个DEPs中有近三分之一(22 / 69)的DEPs参与了NADH介导的呼吸氧化磷酸化(ORR)氧化还原反应(图3B)，包括DesA2、FixB、FadB、SodA、AcpM、AhpC、SirA，其中SirA在铁代谢中起重要作用。富集簇的分子功能表明它们主要参与NAD和离子的结合(图3C~E)，有3个分泌蛋白，分别为Rv2244、Rv1094和Rv0860，已通过qRT-PCR进一步证实(图3F)。上述结果提示Rv1258c可能参与了结核分枝杆菌的氧化应激反应。

图3 采用TMT标记的定量蛋白质组学分析方法分析H37Rv Rv1258c与WT样品在培养基中的DEPs。A:火山图所示的检测蛋白; B:以基因功能为代表的DEP; C:基于DEP比率的GO通路分析，分为Q1(0<比值≤1/1.5，P<0.05)、Q2(1/1.5<比值≤1/1.3，P<0.05)、Q3(1.3<比值≤1.5，P<0.05)、Q4(比值>1.5，P<0.05); D:通过GO注释将分泌蛋白分为三类：生物过程、细胞隔室和分子功能(下降)。E: Q类功能富集KEGG通路; F：选择8个qRT-PCR检测基因的表达量

4. Rv1258c参与结核分枝杆菌的氧化应激：使用DiOC2(3)测定膜电位，结果表明，不同浓度的泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）可以干扰H37Rv Rv1258c的H+梯度 (图4A和B)。与WT样本相比，H37Rv Rv1258c中NAD+/NADH的比值显著增加(图4C)。qRT-PCR结果显示，与WT样品相比，Rv1258c中NDH (Rv1854c)的表达增加，Icd (NADP；Rv0066)降低(图4D)。检测2株菌株的ROS水平，发现H37Rv Rv1258c的ROS水平更高(图4E)。这些结果表明，Rv1258c可能与氧化应激有关。外排泵Rv1258c的敲除下调了AhpC和SodA的表达(图4F)。Rv1258c的缺失导致MmpL6和MmpL11的表达下降，但MmpL3和MmpL5的表达没有明显变化，这表明MmpL蛋白家族中的一些蛋白也受到Rv1258c的调控(图4G)。Rv1258c缺失后KgtP显著降低(图4H)。上述结果表明，Rv1258c缺失导致H+流量失衡，外排泵MSF和MmpL家族表达受到抑制，氧化应激系统明显被激活。

图4 膜电位和氧化应激。A:在CCCP存在或不存在的情况下，WT样品和H37Rv Rv1258c与3 mM DiOC2(3)孵育的膜电位的FACS图像; B:对应A图的膜电位统计图; C: WT样品和H37Rv Rv1258c中NAD+与NADH的比值; D:采用qRT-PCR检测NADH脱氢酶(Ndh, Rv1854c)和异柠檬酸脱氢酶(Icd2, Rv0066)基因表达量; E: O11荧光探针的荧光强度，显示WT样品和H37Rv Rv1258c中的ROS; F:负责降解ROS的清除酶mRNA水平的定量结果; G: MmpL3、MmpL5、MmpL6和MmpL11在WT样本和H37Rv Rv1258c中的相对mRNA表达量; H: KgtP在WT和H37Rv Rv1258c中的相对mRNA表达量

研究结论

外排泵Rv1258c不仅具有调节结核分枝杆菌耐药的功能，还具有激活氧化应激和调节结核分枝杆菌ESX-3相关铁代谢的新功能。

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编辑：王   然

审校：郭   萌

发布日期：2023-11-21

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