LRRC25通过抑制IFN-γ的分泌负向调节小鼠小胶质细胞的抗结核免疫

作者：盛钢，褚洪迁，段惠娟，王文敬，田娜，刘丁一，孙宏，孙照刚

第一作者及单位：盛钢，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病胸部肿瘤研究所

通信作者及单位：孙照刚，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病胸部肿瘤研究所；孙宏，首都医科大学附属北京胸科医院/北京结核病胸部肿瘤研究所

LRRC25 Inhibits IFN-γ Secretion by Microglia to Negatively Regulate Anti-Tuberculosis Immunity in Mice.

Sheng G, Chu H, Duan H, Wang W, Tian N, Liu D, Sun H, Sun Z.

Microorganisms, 2023, 11(10):2500. 

doi:10.3390/microorganisms11102500.

PMID: 37894158. 

01背景

结核性脑膜炎所导致的神经炎症主要表现为小胶质细胞（BV2）、星型胶质细胞的激活和炎症介质的增加，而BV2细胞是神经炎症变化最显著的免疫效应细胞，负责识别和内化结核分枝杆菌（MTB）。亮氨酸重复蛋白25抗体（LRRC25）能够与干扰素刺激基因15（ISG15）结合，介导ISG15自噬，抑制IFN-α的正反馈调节，负向调控巨噬细胞的抗病毒免疫，但LRRC25在细菌感染中的作用尚不清楚，因此，明确LRRC25在BV2细胞中的功能和机制有助于了解结核性脑膜炎的免疫致病机理。

02方法

1.通过Real time-PCR (Q-PCR)、Western Blotting (WB)、细胞免疫荧光法观察结核分枝杆菌（H37Rv）感染小鼠小胶质细胞后，LRRC25基因和蛋白水平的差异表达。

2.进一步设计并合成针对LRRC25的siRNA，利用Lipofectamine RNAiMAX载体将其运输至BV2细胞内，以沉默LRRC25的表达，通过Q-PCR和WB验证其沉默效果。

3.H37Rv感染沉默LRRC25后的BV2细胞，通过流式细胞术和激光共聚焦成像观察LRRC25沉默后BV2细胞的感染情况，评估LRRC25在小胶质细胞中抗结核感染的作用。

4.通过Q-PCR和（或）ELISA测定感染BV2前后及转染前后各组培养上清中的IFN-α、IFN-γ和ISG15的变化水平，推测LRRC25调节小胶质细胞的天然抗结核免疫机制。

5.分别使用重组蛋白ESAT-6-CFP10 (EC, 25 μg/ml)、脂多糖（LPS；1.5 μg/ml）、纯蛋白衍生物（PPD；1.5 μg/ml）、H37Rv（MOI为5）刺激转染72 h后的BV2细胞，评估4种物质激活LRRC25-ISG15-IFN-γ免疫调节轴的能力。

03结果

1. BV2细胞受到H37Rv感染后LRRC25表达上调：细胞免疫荧光法、Q-PCR和WB检测显示，BV2细胞在感染H37Rv后，LRRC25的基因和蛋白水平表达均上调（图b，c，d）。随后，通过成功构建的小鼠脑膜炎模型（图e，f），免疫组织荧光双染显示，小鼠脑组织中BV2细胞的LRRC25表达上调。

图1

在H37Rv感染的BV2细胞中，LRRC25的转录和翻译增加。a：激光扫描共聚焦图像确定最佳感染复数（MOI）；b：H37Rv感染BV2细胞4 h后，LRRC25的Q-PCR定量结果；c：H37RV感染BV2细胞4 h后，LRRC25的WB图像；d：H37Rv感染BV2细胞4 h后，LRRC25的细胞免疫荧光图像；e：小鼠脑组织在2、4和6周时的H37Rv 细胞菌落形成单位（CFU）计数；f：感染H37Rv的小鼠在0、2、4和6周时大脑区域的HE染色图像；g：H37Rv感染小鼠6周时脑组织LRRC25及IBA-1的免疫荧光图像

2. LRRC25负向调控小鼠BV2细胞的抗结核免疫：设计并合成针对LRRC25的siRNA，使用siRNA干扰BV2细胞中LRRC25的表达。在3种siRNA中，L1具有最佳的干扰效果（图a，b），即使被H37Rv感染、转染72 h后，LRRC25的表达也能被有效干扰（图c，d）。流式细胞术和细胞免疫荧光显示，LRRC25表达被干扰的BV2细胞，抵抗H37Rv感染的能力增强，受感染BV2细胞的比例明显下降（图e，f）。

图2

LRRC25负向调控BV2细胞抗结核免疫。a：转染BV2细胞48 h和72 h后，LRRC25的Q-PCR定量结果；b：转染BV2细胞48 h和72 h后，LRRC25的WB图像；c：转染48 h和72 h并感染GFP-H37Rv（MOI=5）4 h后，LRRC25的Q-PCR定量结果；d：转染48 h和72 h并感染H37Rv（MOI=5）4 h后，LRRC25的WB图像；e：转染72 h并感染GFP-H37Rv（MOI=5）4 h后，流式细胞术中未感染BV2细胞的点图和百分比统计；f：转染72 h并感染GFP-H37Rv（MOI=5）4 h后，BV2细胞的免疫荧光图像

3. LRRC25是BV2细胞释放IFN-γ的负调节因子：LRRC25被干扰后，BV2细胞被H37Rv感染后，仍旧释放较高水平的IL-1β（图a），这表明BV2细胞被有效激活。研究表明，ISG15的合成缺陷所致的IFN-γ释放不足是孟德尔遗传分枝杆菌易感病（MSMD）的核心环节，因此，我们测定了受感染的BV2细胞分泌IFN-α、IFN-γ、ISG15的水平情况。结果显示，受感染的BV2细胞分泌IFN-γ和ISG15的水平下降（图b），而H37Rv感染的抑制作用可以通过干扰LRRC25得以有效挽救（图c，d，e）。

图3

LRRC25可阻止BV2细胞释放ISG15和IFN-γ。a：各组BV2细胞分泌IL-1β的Q-PCR定量结果及培养上清中分泌IL-1β的水平；b：BV2细胞被H37Rv感染前后，细胞培养上清中IFN-α、IFN-γ和ISG15的分泌水平；c：各组BV2细胞分泌ISG15的Q-PCR定量结果及培养上清中IL-1β的分泌水平；d：各组BV2细胞培养上清中IFN-γ的分泌水平；e：各组BV2细胞培养上清中IFN-α的分泌水平

04结论

BV2细胞被MTB感染后，LRRC25可能与ISG15结合，抑制ISG15介导的IFN-γ分泌，负向调控BV2细胞抗结核免疫，防止BV2细胞的过度激活（图4）。

图4 LRRC25-ISG15-IFN-γ轴对小胶质细胞抗结核免疫的负调控作用

注：除非特别声明，本公众号刊登的所有文章不代表《中国防痨杂志》期刊社观点。

供稿：盛    钢

编辑：孟    莉

审校：范永德

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