如何检测基因敲除细胞系的编辑效率？

想必很多小伙伴在进行基因敲除细胞实验时，都会有以下烦恼：

如何监测实验结果？

如何验证编辑结果？

怎么检测基因编辑的效率？

根据实验目的和基因编辑的性质，可以使用多种检测方法，获得不同数量和类型的信息。本文总结了以下7个最常用的检测基因编辑效率的方法以及各种方法的优缺点，希望能帮助到你。

 一、错配检测实验（Mismatch detection assay）

 突变类型：插入或缺失(INDEL)导致的基因敲除。

 检测说明：核酸内切酶，如T7 内切酶 I 可识别 DNA 异源双链体的结构畸变。通过凝胶电泳分离裂解片段，确定 DNA 的裂解率和基因编辑率。www.edgene.cn

 应用：快速估算混合种群中的基因编辑率。确定最有效的实验条件。筛选单个克隆进行进一步分析。

 优点：操作简单，性价比高 。

 缺点：没有关于靶蛋白核苷酸序列或功能的信息。不适用于检测纯合突变体（同源突变体）。并非所有错配的检测效率都相同。不适合高通量实验。

 二、限制性片段长度多态性-RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）

 突变类型：插入或缺失(INDEL)，单核苷酸多态性(SNPs)。

 检测说明：限制性内切酶识别位点产生SNP 或删除会被位点特异的PCR引物扩增。限制性酶切后，裂解的片段通过凝胶电泳分馏成易于区分的模式。

 应用：快速估计混合人群中HDR百分比。确定最有效的实验条件。筛选单个克隆，通过测序进行进一步分析。

 优点：简单，性价比高。检测SNP和纯合突变体。

 缺点：需要限制性位点多态性。没有关于核苷酸序列或功能的信息。

 三、桑格测序（Sanger sequencing）

 突变类型：包括所有类型的基因敲除或点突变。

 应用：分析基因组DNA周围可能的突变位点。

 检测说明：分析单细胞克隆的基因型，例如等位基因频率和编辑的序列。

 优点：知道每个等位基因的核苷酸序列信息。

 缺点：无功能信息，耗时较长。

 四、蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）

 突变类型：插入或缺失(INDEL)，单核苷酸多态性(SNPs)，报告基因。

 检测说明：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳提取和分离细胞蛋白，然后转移到膜上，杂交到蛋白质特异性抗体和二级检测抗体。

 应用：监测蛋白表达水平。

 优点：简单，性价比高，显示可能的蛋白敲除。

 缺点：没有关于核苷酸序列的信息。蛋白质检测的缺失/存在并不总是与功能状态相关。需要特异性抗体。

 五、表型分析（Phenotypic assay）

 突变类型：所有类型v

 检测说明：通常针对靶基因或细胞通路的各种检测，例如监测酶活性、细胞表面标志物、细胞凋亡或荧光报告基因。

 应用；监测或描述敲除细胞系的表型变化及其生物学相关性。确定最有效的条件。选择所需的表型进行克隆。

 优点：可实现高通量。功能信息和生物学相关性。

 缺点：没有关于核苷酸序列的信息。

 六、高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）

 突变类型：所有突变类型。

 检测说明：克隆细胞系的基因组DNA进行高通量测序。

 应用：分析细胞的基因型，例如等位基因频率和编辑的序列、 识别脱靶、在混合CRISPR筛选的背景下，鉴定细胞群中富集或消耗的基因。

 优点：高通量，核苷酸序列信息。

 缺点：没有功能信息。

 七、 缺失序列的追踪分析（Tracking of Indels by DE composition，TIDE）[3]

 突变类型：插入或删除。

 检测说明： TIDE 软件采用分解算法，根据编辑样本和对照样本（未编辑）PCR 扩增子的两个标准 Sanger 测序反应 的定量序列追踪数据，量化目标细胞群 DNA 中主要插入和缺失类型的识别和频率。

 应用：估计混合群体的基因编辑百分比和插入缺失大小。

 优点:成本低，给出了插入缺失光谱的概念。

 缺点:不能解决大量的缺失和低质量的测序运行。

 总结:

 在大多数情况下,需要在分子和表型水平上对编辑进行验证和表征，以评估其生物学相关性。

 蛋白免疫印迹（WB）、TIDE、RFLP 或表型检测通常用作评估 CRISPR 实验成功与否的起点并筛选具有所需的基因敲除细胞或点突变细胞的阳性克隆。通常，第一步之后，将在序列级别和功能级别上更深入地描述编辑的性质。因此，在基因编辑实验中，将连续应用多种检测方法。

 参考文献：

 1. R. D. Mashal, J. Koontz, j. Sklar, Detection of mutations by cleavage ofDNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases..Nat Genet 9.177-1831995)

 2. L. Vouillot, A. Thelie, N. Pollet, Comparison of T7El and surveyor mismatchcleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3Bethesda) 5.407-415 (2015).

 3. E. K. Brinkman, T. Chen, M. Amendola, B. van Steensel, Easy quantitativeassessment of genome editing by sequence trace decomposition. NAR 42lssue 22, Pages e168 (2014)

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