开发设计有效的个性化新抗原肿瘤疫苗

最近肿瘤免疫疗法的成功凸显了利用免疫系统治疗肿瘤的益处。靶向肿瘤新抗原的疫苗已被支持作为指导和增强针对肿瘤的免疫反应同时不伤害健康组织的工具。近年来，广泛的临床前研究和100多项临床试验测试了新抗原发现和疫苗配方的不同策略。然而，尽管人们对新抗原疫苗充满热情，但大多数临床试验仍然无法证明明确的有效性。这里重点关注与疫苗设计和肿瘤环境相关的关键障碍，这些障碍仍有待克服，以释放新抗原疫苗在癌症治疗中的真正潜力。

到目前为止，在ClinicalTrials.gov上搜索“疫苗”和“新抗原”这两个词时，有100多项正在进行或已完成的临床试验。这突显了新抗原疫苗的前景和投入的努力。直到最近，这些治疗性疫苗试验还没有显示出明显的临床益处。然而，最近的两项试验（NCT03897881治疗黑色素瘤和NCT04161755治疗胰腺癌）已经报告了延长无复发生存期(RFS)的临床益处的证据。NCT03897881是对切除的黑色素瘤患者进行的IIb期试验，该试验将ICB+新抗原mRNA疫苗与单独ICB进行比较。这项研究的注意事项是适度的统计能力和相对较短的随访时间。在NCT04161755试验中，所有胰腺癌患者在手术切除肿瘤后接种了新抗原mRNA疫苗，患者还接受了ICB和化疗。在对新抗原产生T细胞免疫的疫苗应答者中，与那些对疫苗无反应的患者相比，报告的RFS延长。这项研究的注意事项包括患者数量较少、肿瘤体积明显较小、以及应答者在接种疫苗前肿瘤切除时的疾病分期较低。众所周知，后一种因素会影响胰腺癌的复发和存活率。显然，在黑色素瘤和胰腺癌方面的这些有希望的结果需要通过更大规模的试验来证实。尽管有了临床疗效的初步证据，但在新抗原疫苗能够充分展示其临床潜力之前，仍必须解决一些关键挑战。

设计有效的新抗原疫苗

新抗原疫苗平台免疫原性研究现状

到目前为止，许多新抗原靶向疫苗平台已经进入临床试验，其中包括基于多肽、DNA、RNA、腺病毒和DC的疫苗，其中超过50%的试验使用合成长肽(SLP)和佐剂组合。尽管这些平台能激发T细胞对癌症相关靶点的免疫，但仍然存在一个主要问题，那就是它们的免疫原性总体较低。通常，在这些试验中诱发的新抗原特异性T细胞反应，特别是细胞毒性CD8+T细胞(CTL)反应，在患者外周血中直接检测时是无法检测到的或非常小的。在这类研究中，一种常见的做法是报告体外扩增后检测到的新抗原特异性T细胞反应(通常被误称为“体外刺激”)。这确实报告了在新抗原肽和刺激性细胞因子存在的情况下，体外扩增7-14 天后，新抗原特异性T细胞的反应。要了解当前疫苗平台的免疫原性，需要将新抗原特异性疫苗策略与成功的病原体特异性T细胞疫苗的免疫原性进行比较。例如，黄热病减毒疫苗(YFV-17D疫苗)和活牛痘病毒疫苗(Dryvax天花疫苗)可诱导机体产生强大的终生免疫应答，其中针对单个表位的病毒特异性CTL反应约占总CTL的10-20%。与之相反，描述新抗原疫苗“成功”的研究报告称，在血液中诱导的新抗原特异性CTL反应从不可检测到小于总CTL的0.1%不等。毫不奇怪，这些反应没有临床益处。然而，重要的是，血液CTL测量可能不能反映疫苗诱导的T细胞在肿瘤组织和引流淋巴结中的丰度，其中疫苗诱导的T细胞可以在晚期积聚。然而，比较病毒疫苗和新抗原疫苗的血液T细胞反应表明，目前新抗原疫苗平台的免疫原性较低，很可能是由于新抗原的固有特性，它们提供的抗原负载量较低，以及它们的免疫刺激能力不佳。总体而言，T细胞免疫的大小并不是决定临床益处的唯一因素。即使在少数几个疫苗诱导对肿瘤相关抗原(TAA)产生强烈的体外T细胞反应的情况下，临床益处也没有报道，这突出了实现疫苗效力需要克服的额外障碍。

虽然人们普遍认为CTL对抗肿瘤免疫的贡献是特别重要的，因为它们具有直接的细胞毒作用，但对抗肿瘤的CD4+T细胞的关注要少得多。尽管大多数肿瘤不表达MHC II类分子，但新抗原特异性的CD4+T辅助细胞1(TH1)细胞可以通过多种方式帮助抗肿瘤免疫，包括在启动和效应阶段为CTL提供帮助，产生上调MHC I类分子的细胞因子，以及增强髓系细胞的抗肿瘤效应。此外，细胞毒性的CD4+T细胞已在患者中被描述，并可介导对表达MHC II类肿瘤的杀伤；然而，它们在肿瘤防御中的总体作用仍未完全阐明。疫苗诱导免疫的一个方面在新抗原疫苗临床研究中经常被忽视，那就是诱导辅助性T细胞(TH2)细胞免疫，因为大多数批准的佐剂都经过了优化，可以诱导TH2和/或T滤泡辅助细胞，以对靶抗原产生体液反应。这种反应主要是通过中和抗体，保护宿主免受病原体的感染和传播，但不能单独促进细胞内病原体的清除。然而，在肿瘤疫苗开发的情况下，这是至关重要的，因为最佳的抗肿瘤反应涉及新抗原特异性TH1细胞和CTL，而不是TH2免疫。TH2细胞在肿瘤环境中的保护作用仍然存在争议，这些细胞通常被认为是不受欢迎的，因为它们可以支持更多的抗炎和耐受反应，从而促进肿瘤的生长。由于胸腺中T细胞对自身抗原的阴性选择，新抗原特异性TCR的亲和力往往较低。这种低的TCR亲和力通常倾向于将免疫偏向TH2型，而不是TH1型免疫反应。因此，在新抗原疫苗试验中正确评估TH2型免疫可能有助于洞察特定疫苗方法在临床试验中失败的原因，以及通过使用特定疫苗佐剂组合进行免疫调节以获得最佳抗肿瘤反应来避免或克服此类缺点的方法。

综上所述，很明显，如果要实现针对新抗原的临床相关T细胞反应，现有的疫苗平台需要进一步优化，或者必须开发新的平台。疫苗研发迭代过程的关键将是对体外CD4+和CD8+T细胞免疫的大小和质量以及引发的TH1-TH2细胞分化模式的一致报告。多肽刺激后，通过ELISpot试验和细胞内细胞因子染色结合流式细胞术，可以监测体外T细胞反应的数量和质量。这种报告应作为一种最佳实践程序纳入所有新抗原疫苗试验，因为它将允许比较疫苗形式和临床试验(如下图)。

新抗原选择的瓶颈

任何疫苗的效力关键取决于其抗原的质量和免疫原性，新抗原疫苗也是如此。NGS提供了关于个体肿瘤和个体患者前所未有的遗传信息。这使得能够通过生物信息学分析和MHC-肽结合预测算法来预测潜在的新抗原肽 (图1)。肿瘤和血细胞的全外显子组测序(WES)能够鉴定遗传变化，例如单核苷酸变异(SNV)、插入、缺失和移码突变，这些突变可以产生全新的新肽序列(图2)。基于RNA水平可能反映多肽表达和细胞表面特异性MHC-多肽的丰度的假设(可能过于简单化)，肿瘤的RNA测序(RNAseq)被用来优先考虑新的候选多肽。利用这种WES和RNAseq方法，已经开发了一些生物信息学管道，这些管道使用算法来预测MHC I类和MHC II类分子的多肽产生和呈递。预测与MHC结合的多肽的计算算法已被证明对I类表位比II类表位更成功。确认的免疫原性I类新肽经常与其计算预测的与MHC I类结合一致，而确认的免疫原性MHC II类新肽通常无法通过算法正确预测。尽管免疫原性新肽富含被预测能更好地与MHC I类结合的多肽，但查询其他多肽特征的算法也已被使用，例如多肽切割和抗原运输。一些算法，如免疫原性表位预测(PRIME)，结合了抗原呈递和TCR识别来识别免疫原肽。此外，新肽的异质性或与自身的不相似性被用作预测特征，这可以提高总体免疫原性。

然而，这些生物信息学管道的效率仍然存在争议。在对已发表研究的一项分析中，所使用的生物信息学预测方案优先考虑新肽，其中只有不到2.7%的新肽被患者来源的T细胞识别。与此相一致的是，肿瘤新抗原选择联盟(TESLA)全球联合会报告了这一发现。在这份报告中，该联盟的每个参与成员都从共享的肿瘤测序数据中预测了免疫原性新肽。预测的新肽与MHC络合，并测试与患者匹配的T细胞的结合。当针对患者T细胞进行测试时，只有大约6%(608个中的37个)预测的新肽被T细胞识别。这些类型的分析质疑了当前预测管道的稳定性。然而，考虑到在这些方面投入的大量努力，这种生物信息学管道的稳定性预计将得到改善。进一步的改进可以包括机器学习方法，该方法询问有效的T细胞刺激新抗原的多个特征，或者使用免疫表位衍生的多肽特征来改进对天然处理和呈递的新表位的预测。

依赖患者现有的抗肿瘤T细胞免疫来验证肽靶标的一个警告是，由肿瘤细胞表达和呈递的一些新肽可能无法自发地诱导患者的T细胞免疫。因此，按照上述选择方法，可能会在疫苗接种后特异性地诱导保护性抗肿瘤反应的新肽可能会被丢弃。肿瘤和/或抗原提呈细胞(APC)上的MHC分子可以低水平表达或呈递这种新肽，但如果与有效的佐剂结合，它们很可能是免疫原性的。幼稚T细胞需要识别高密度的多肽-MHC-I复合体，才能在体内分化为效应性CTL，因此新肽的低水平表达可能无法启动免疫。这进一步被抑制DC介导的共刺激和引流淋巴结中的抗原递呈的免疫抑制肿瘤微环境(TME)混淆，这两者都是幼稚T细胞激活所必需的。相比之下，效应CTL杀伤所需的多肽-MHC I复合体少于10个。重要的是，由于MHC-I限制性新抗原特异性T细胞反应的诱导依赖于最初的CTL反应的交叉递呈，所以不能很好地交叉递呈的新肽将不会诱导自发的内源性抗肿瘤免疫。事实上，通过直接递呈途径(在肿瘤细胞中)或交叉递呈途径(在专职APC中)的MHC I递呈效率显示出对呈递宿主蛋白的抗原性的不同要求。例如，基于插入或缺失的肿瘤突变可能导致多肽序列的移码翻译，而与野生型对应的多肽序列没有同源性或几乎没有同源性。随之而来的功能和结构稳定性的缺乏使这些新抗原成为有缺陷的核糖体产物(DRiPs)，它们是快速降解的靶标，有效地供给直接的MHC I递呈途径。尽管加工后的多肽可以通过例如与热休克蛋白的结合或通过缝隙连接发生向APC的转移，但交叉提呈主要依赖于稳定的抗原，而不是DRiPs，这可以解释为什么移码新抗原（以及其他蛋白质稳定性降低的突变自身抗原）可能只通过交叉提呈低效地启动CTL反应。这可能会阻碍患者对这种不稳定的新抗原产生自发的T细胞免疫，这一限制可以通过加强交叉呈递的疫苗平台或佐剂来克服。因此，有效的新抗原疫苗与短命抗原在靶细胞上的MHC-I递呈增加的事实相结合，可能是诱导有效的抗癌CTL反应的解决方案的一部分。因此，依赖现有的T细胞免疫来验证患者的新肽存在丢失呈递良好的肿瘤特异性多肽的风险，这些多肽由于低效的交叉呈递而不能在体内引发效应CTL反应，但在有效疫苗诱导CTL后，这些多肽可能成为肿瘤杀伤的极佳靶点。

最近，生物信息学新抗原肽预测受到了免疫表位学方法的进一步挑战，这些方法使用质谱来直接鉴定装载在肿瘤表面MHC I分子上的新肽(图1)。这些方法发现免疫肽与RNAseq表达谱和通过核糖体谱(RiboSeq)分析的蛋白质翻译没有相关性，这表明表达水平或翻译效率不一定代表新肽呈递效率的预测因素。值得注意的是，免疫表位学鉴定的一些新多肽在肿瘤中只有最少的同源mRNA表达，支持了先前提出的假设，即特定的多肽可能优先进入抗原呈递机制。这些观察结果挑战了大多数根据RNA转录丰度对新肽进行优先排序的新肽预测管道。因此，将基于MS的免疫表位学应用于肿瘤将是鉴定免疫原性肽的更直接的方法。然而，这些方法需要进一步改进，因为它们目前受到以下因素的阻碍：通过浸润细胞进行免疫表位稀释、所需的大量肿瘤材料或细胞、肿瘤上MHC I的低表达，以及由于肿瘤中APC数量少或失活而导致MHC II的次优水平。这些问题的一种解决方案可以由肿瘤衍生的类器官提供，类器官可以作为大量同质肿瘤细胞的来源。这些可以被操纵来增加MHC I的表达，并被用于WES，RNAseq和免疫表位，潜在地提高了新表位发现的敏感性。

图1 新抗原发现和疫苗设计的最新方法。a，从癌症患者的外周血、肿瘤活检和对照组织中提取，以分析新抗原的存在。b，使用癌症和对照组织的下一代DNA测序绘制癌症特异性突变(DNA突变图景)。然后通过RNA测序确定这些突变在癌细胞中的表达，以建立肿瘤的整体基因表达谱(RNA转录组)。c，核糖体分析(RiboSeq)用于鉴定在肿瘤和健康组织中实际翻译的蛋白质产物(翻译组)。这可以与DNA或RNA测序相结合，以鉴定被翻译成新抗原的突变。除了分析经典开放阅读框架(ORF)中的蛋白质翻译外，该方法还可以鉴定可能在癌症中作为新抗原的非规范或隐性的翻译产物。d，为了鉴定MHC-I分子呈现在癌细胞表面的新抗原衍生肽，在MHC免疫沉淀和从癌症和对照组织(免疫肽)中提纯多肽后，进行了基于质谱的抗原肽的检测。这与DNA测序和/或RiboSeq相结合，用于在质谱数据中发现有针对性的新抗原肽。e，利用生物信息学平台整合这些多组学方法产生的数据。根据方法的不同，新抗原的优先顺序是基于突变肽(对于突变依赖的新抗原)、RNA表达水平、癌症特异性翻译(RiboSeq)、其生物信息预测的MHC I结合强度和异质性或其确认的MHC I在癌症上的呈递(免疫表位学)。然后合成基于多肽、基于RNA或基于DNA的疫苗。f，根据疫苗的不同，抗原递送系统(如RNA或多肽疫苗的胶囊或纳米颗粒)和佐剂(多肽疫苗)需要最大限度地进行抗原递送和免疫刺激。抗原递送系统和选定的佐剂都是需要优化以实现疫苗临床效果的关键参数。

一类特殊的依赖突变的新抗原可由癌基因和肿瘤抑制基因的驱动突变产生。从理论上讲，这样的疫苗靶点是非常可取的，因为它们是所有肿瘤克隆所产生的主干突变，而任何逃逸突变都会损害重要的致癌途径。被高TCR亲和力识别的免疫原性新抗原可以在驱动突变中发现，例如KRAS G12D、p53 R175H、IDH1 R132H、PIK3CA H1047L、EGFR L858R和EGFR T790M和其他。其中一些突变在某些癌症中相当常见，它们的新表位由多个HLA分子呈现。例如，KRAS G12D在大约32%的胰腺癌中存在，并与HLA-A*03、HLA-A*11:01和HLA-C*08:02相关。针对这种驱动突变的疫苗接种研究结果喜忧参半，其中一些研究表明对胃肠道癌症没有益处，而另一些研究提供的证据表明在胶质瘤和NSCLC中有轻微的临床益处。这突出表明，当潜在突变对肿瘤至关重要时，以单个新表位为靶点，即使在肿瘤突变负担较低的癌症中也可以提供益处。由于来自复发性驱动基因突变的新抗原在患者之间是共享的，它们有可能作为公共新抗原，当与患者的HLA适当匹配时，可作为现成疫苗的靶点。因此，对驱动突变衍生的新表位的免疫原性和HLA限制性进行分类，可能为肿瘤疫苗提供重要的新抗原来源。

突变依赖的新抗原的一个普遍问题是在原发癌和转移性肿瘤中发现的肿瘤内异质性和克隆多样性。肿瘤内的遗传多样性表明，并不是所有的新抗原都是疫苗的良好靶点。最好，癌症中所有肿瘤细胞携带的主干突变将比分支突变更好地作为疫苗靶点。然而，破译竞争最激烈和最常见的肿瘤克隆携带的分支突变的真正主干并不是一件容易的事。肿瘤的免疫编辑对最具免疫原性的肿瘤抗原施加了免疫选择压力，可以选择抗原性降低的肿瘤克隆，从而能够逃避T细胞免疫。这也可能发生在疫苗靶向的新抗原上，特别是如果诱导的T细胞免疫只有部分有效，允许替代克隆生长出来。因此，如果使用次优的抗原-佐剂组合，肿瘤的遗传异质性和免疫编辑可以阻碍新抗原疫苗。表位扩散（即T细胞对疫苗中未包括的抗原的免疫扩展）可能提供一种方法，引发针对这些逃逸克隆的更多样化的反应，从而绕过肿瘤克隆多样性带来的挑战。在接种疫苗或肿瘤排斥反应后，这种表位扩散在患者和临床前模型中都有很好的记录。如何在新抗原接种后最大限度地扩大表位扩散是未来的重要挑战。

由此可见，免疫相关新肽的预测仍然是个性化肿瘤疫苗发展的主要障碍。确定哪些新肽确实能被肿瘤表面的MHC I分子提呈，哪些能有效地被DC交叉提呈，仍然是一个挑战，需要敏感的免疫表位肽与NGS相结合来解决这个问题。

不依赖突变的新抗原

依赖突变的新抗原策略的缺点是许多癌症的突变负担很低，这使得识别新抗原疫苗靶标变得特别困难。因此，扩大对治疗相关突变非依赖性新抗原的研究是有意义的。尽管来自癌症相关突变的改变蛋白具有真正的肿瘤特异性的优势，但它们并不是唯一可以作为免疫治疗靶点的新抗原类型(图2)。研究表明，转录和翻译中的非规范或“隐性”变化可以导致替代性蛋白产物的表达，这些蛋白产物与细胞的常规蛋白质组几乎没有重叠。近年来，蛋白质组的这种“暗物质”(有时被称为“暗蛋白质组”)受到了各个细胞生物学领域研究人员的越来越多的关注，尤其是试图为癌症免疫治疗鉴定隐性的新抗原靶点的科学家(图2)。隐性翻译产物可能源于选择性剪接事件（包括产生环状RNA）通过使用替代的非AUG起始密码子进行翻译起始和核糖体移码错误。此外，3’-UTR的通读事件以及基因组中非编码区的表达（包括长非编码RNA的翻译）都可能导致隐性的蛋白质。尽管作为一种细胞现象的隐性表达已经得到了很好的证实，但暗蛋白质组的癌症特异性仍然是一个关键问题。如今，将核糖体足印(profiling)与NGS(RiboSeq)相结合的开创性工作允许全局映射和量化细胞翻译，而不依赖于特定的基因注释。RiboSeq与经典的免疫表位学方法相结合，可以鉴定在MHC I分子背景下存在的隐性肽，最近的研究表明，隐性抗原可以构成癌症相关免疫肽的主要部分。在这个阶段，隐性抗原是否可以是癌症特异性的还有待阐明，还需要更多的研究来证明它们在癌症免疫治疗中的潜力。癌细胞生物学中出现的特殊变化，包括细胞代谢、生长速度、能量消耗和蛋白质折叠，增加了癌症特异性翻译事件可能导致肿瘤特异性新抗原表达的可能性。类似地，癌症特有的途径可以促进蛋白质组翻译后修饰模式的改变。通过这种方式，翻译后修饰可能会影响规范和非规范以及突变和非突变的MHC I表位的免疫异质性，从而潜在地产生癌症特异性新抗原。此外，蛋白酶体多肽剪接是一种已被证明能够产生非胚系编码的、非规范的MHC I配体的过程，可以引发CTL应答。尽管整体的生物学意义、频率和调控仍然是一个有争议和正在进行的研究问题，癌细胞中的不受调控的或选择性多肽剪接可能产生对免疫治疗感兴趣的肿瘤特异性抗原。

总体而言，类似于移码突变产生的新抗原，很大一部分隐性蛋白产物的半衰期可能很短，使它们有资格快速蛋白酶体降解和有效地直接MHC I呈递。作为一种观点，它们的非突变性质与癌症特异性细胞生理学的复发性模式相结合，可能使在不同基因的肿瘤中识别共享的、不依赖突变的新抗原靶点成为可能，为实现现成的肿瘤疫苗指明新的途径。另一方面，不依赖突变的暗肽表位可能在肿瘤克隆中不同程度地表达，而对肿瘤不是必需的，使免疫编辑和疫苗在没有表位扩散的情况下更容易逃脱。鉴于上述情况，靶向暗蛋白质组提供了机会，但其整体效用仍有待确定。

图2 肿瘤疫苗接种中新抗原类型和来源的概述。该循环说明了癌症特异性T细胞的诱导。肿瘤特异性抗原是从受损或死亡的癌细胞中自然释放出来的，并由专业的抗原提呈细胞(APC)摄取。在淋巴结中，APC交叉呈递MHC I背景下的癌症相关抗原，以启动CD8+T细胞(交叉启动)。最后，效应CD8+T细胞迁移到肿瘤部位，在那里它们以抗原依赖的方式杀死癌细胞。这可以通过表位扩散来放大免疫。CD4+T细胞是由APC上的MHC-II提呈物激活的，可以帮助CD8+T细胞，诱导MHC-I分子对癌细胞的作用，激活髓系细胞的细胞毒作用，并可能对肿瘤产生直接的杀伤作用。癌症疫苗绕过了从肿瘤转移抗原的要求，直接使APC能够启动癌症特异性T细胞。上面的部分显示了肿瘤新抗原被细分为两大类：“突变依赖型”和“突变非依赖型/暗蛋白质组”。在这两类中，有四种可能的机制可以产生新的抗原：(1)基因：突变依赖的新抗原是遗传起源的，通过染色体易位、插入和缺失或体细胞中的单核苷酸变异而发生；(2)转录：不依赖突变的新抗原可以来自各种机制，包括选择性剪接事件；(3)翻译：在翻译水平上，新抗原可通过核糖体滑动、非AUG起始密码子的翻译起始、3’-UTR的翻译、基因组非编码区或上游开放阅读框(ORF)的翻译而产生；(4)翻译后：新抗原可由翻译后修饰、癌症特异性抗原加工或蛋白酶体肽剪接而产生。理想情况下，在鉴定用于肿瘤疫苗的新抗原时，应考虑所有潜在的新抗原来源。

疫苗所需的新肽的数量和长度

经常被忽视的两个重要问题是：什么是最佳的新肽表位？以及在新抗原靶向疫苗中需要包括多少表位才能发挥效力？虽然，被高TCR亲和力识别的单个高表达的模型肽足以引发肿瘤损伤和炎症，从而导致表位扩散和肿瘤消除——正如实验所见，当模型抗原卵清蛋白在肿瘤中表达时TCR亲和力较低的新抗原可能不会发生这种情况，因为新抗原的免疫原性不足以启动T细胞免疫。考虑到SNV新肽与自体肽的相似性，以及与自体肽高亲和力的TCR在胸腺中的消除，寻找具有高TCR亲和力的新肽可能被证明是具有挑战性的。然而，具有高TCR亲和力的新肽可以来自产生新的MHC锚定残基或蛋白酶体切割位点和移码突变的SNV，所有这些都可能无法耐受，但缺点是频率较低。源自SNV的具有高TCR亲和力的新肽的一个例子是上述驱动突变KRAS G12D。此外，暗蛋白质组的新抗原库仍未得到很好的描述，可能会产生具有高TCR亲和力的新抗原肽。有效疫苗所需的新肽的数量可能取决于所包含的表位的性质。即使是一个具有高TCR亲和力的靶向驱动突变的单一新肽，即使在肿瘤突变负荷较低的肿瘤中也能提供适度的临床益处。然而，由于大多数新肽显示出低的TCR亲和力，可能需要许多这样的肽来触发具有高TCR亲和力的模式抗原所看到的炎症和表位扩散的水平。新抗原疫苗接种的黑色素瘤患者有表位扩散的证据，这种肿瘤具有很高的突变负担，尽管体外检测不到新抗原特异性的CD8+T细胞反应，只有在T细胞体外扩增后才能检测到表位扩散。这些结果表明，新抗原疫苗可以发生表位扩散；然而，可能需要更有效的CTL诱导来进一步增加这种扩散。

靶向新肽的长度也是疫苗设计中的一个重要考虑因素。使用可以通过肽交换直接负载到MHC I分子上的短可溶性多肽可以导致多肽呈递在非专业APC(如T细胞)或非免疫细胞(如成纤维细胞或上皮细胞)的表面，这可以导致耐受性，并促进肿瘤生长而不是保护。使用依赖于交叉呈递的更长的多肽可能会提供免疫原性优势。这种较长的多肽可以被设计成包括来自单个突变的所有可能的新肽。原则上，一个编码27个氨基酸的SLP、RNA或DNA可以包含理论上所有可能的MHC I和MHC II多肽，单个突变发生在第14位。

促进T细胞反应的佐剂

尽管目标新肽的选择仍然是疫苗开发的一个重要障碍，但另一个重要问题存在于疫苗佐剂的效力。新肽疫苗尤其需要佐剂，因为来自肿瘤突变的新肽通常类似于自身肽，因此TCR亲和力较低，此外，在没有佐剂的情况下，多肽通常缺乏足够的免疫原性。一些疫苗平台，如病毒疫苗、质粒DNA疫苗和mRNA疫苗，可以作为其自己的佐剂，因为它们可以通过多种模式识别受体(PRR)刺激先天免疫，如Toll样受体(TLRs)、RIG-I样受体和cGAS-STING通路。其他平台，如基于多肽的疫苗，需要外源佐剂来刺激免疫，这是诱导强大的CD4+和CD8+T细胞反应的关键。大多数这样的多肽疫苗平台利用需要DC交叉呈递的SLP，并且需要将它们与适当的佐剂结合来产生有效的新肽特异性T细胞疫苗。关键的是，基于多肽的癌症疫苗表现出将抗原肽和佐剂低效地共同递送到引流淋巴结，并可诱导随后的免疫耐受并降低CD8+T细胞免疫。这就是为什么在典型的多肽疫苗接种方案中，多肽被连接到载体蛋白或TLR激动剂上，或以多聚体形式呈现，以便与佐剂共同递送(例如，使用病毒样颗粒、纳米颗粒或脂质体)的原因。

在过去的100年中，只有6种佐剂被批准用于人类。这些包括铝盐(明矾)、水包油乳剂角鲨烯佐剂MF59、AS01(含有单磷脂A和皂苷部分QS-21)、AS04(含有明矾和单磷脂A)、AS03(含有角鲨烯和维生素E)和合成寡核苷酸CpG 1018。这些佐剂主要是为了诱导抗体介导的保护而设计的，它们诱导CD4+T细胞免疫的能力不同。这些佐剂可诱导不同程度的混合TH1型和TH2型免疫应答。关键是，这些佐剂诱导CD8+T细胞反应的能力远低于病毒疫苗。

最近，上述内容导致了产生增强T细胞反应的佐剂的巨大努力。一些最有效的T细胞免疫刺激分子是PRR激动剂，其中越来越多的分子正在作为疫苗设计的佐剂进行测试。CpG寡核苷酸(CpG-ODN)可通过刺激TLR9激活APC。特别是，K3型CpG ODN(K3 CpG-ODN)是一种诱导体液免疫和细胞免疫的有效佐剂。STING激动剂，如环鸟苷单磷酸-单磷酸腺苷，也可以作为强有力的佐剂，通过诱导I型IFNs来扩增抗原特异性CD8+T细胞。重要的是，TH2型免疫反应也被STING激动剂增强；然而，K3 CpG-ODN和STING激动剂的结合可以关闭TH2型免疫反应，并协同诱导TH1型免疫反应。与单独使用STING激动剂相比，K3 CpG-ODN和STING激动剂可以诱导强大的TH1细胞和针对可溶性新肽的CTL免疫，并且它们不诱导TH2细胞免疫。

如上所述，在临床试验中，近50%的新抗原靶向疫苗使用合成的长链新肽与佐剂结合。在这些多肽疫苗中，超过60%使用poly-ICLC作为佐剂，这是一种人类使用的TLR3配体poly(I:C)的减毒类似物，用作研究药物。这些临床试验报告说，poly-ICLC可诱导低水平但可检测到的针对新肽的体外CD4+T细胞免疫，但远低于无法检测到的体外CTL反应。在一项正在进行的临床试验(NCT03929029)中，已将佐剂Montanide额外添加到使用poly-ICLC的新肽疫苗中。Montanide是一种油基乳剂，会引起炎症并招募APC。Montanide单独或与poly-ICLC或CpG联合接种已用于250多项TAAs临床试验。单独使用Montanide ISA-51VG有利于TH2细胞的反应，在Montanide ISA-51VG中乳化的黑色素瘤来源的多肽诱导特定的TH2 T细胞，但这些细胞的数量随着多次注射而减少。一项研究报告说，基于Montanide的疫苗不能诱导IL-4产生T细胞，但这项研究只显示了一名患者的HLA I肽刺激PBMCs的数据，因此，只检查了CD8+T细胞。然而，Montanide的加入可以提高仅poly-ICLC诱导的CTL反应。这进一步支持了K3 CpG-ODN和STING激动剂组合的情况，即可能需要佐剂组合来实现针对新抗原的CTL免疫所需的效力。由于包括II类限制性新抗原表位的疫苗可能会引起不期望的TH2免疫，因此需要在试验中监测这种反应。

尽管最近针对黑色素瘤的临床试验NCT03897881和针对胰腺癌的临床试验NCT04161755有令人鼓舞的初步证据，但针对新抗原的总体疫苗试验即使与ICB结合也没有显示出多少临床益处，这至少部分可以归因于诱导的T细胞免疫低下。这表明，可能需要更有效的佐剂配方或组合来诱导患者强大的T细胞免疫，其水平与病毒疫苗的水平相当。除了发现具有所需特性的新佐剂外，一个解决方案是现有佐剂的组合，如Montanide+poly-ICLC或K3 CpG-ODN+STING激动剂，以增强疫苗的CTL免疫原性。因此，寻找增强疫苗免疫刺激能力的佐剂，在不诱导TH2细胞的情况下促进TH1细胞和CTL免疫，同时避免将毒性增加到无法耐受的水平，仍然是新抗原疫苗面临的总体挑战。

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