BMP蛋白通路检测与Noggin蛋白活性检测

1.靶点和信号背景

（1）骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）是转化生长因子（transforming growth factor-β, TGF-β）超家族的一员。BMP在出生后骨的稳态包括成骨细胞增殖、分化和骨形成的过程中起着正性调节作用，是调节骨发育和骨代谢的最重要的因素之一[1]。除骨与软骨形成外，BMP信号通路在早期胚胎发育和出生后组织稳态中起着重要作用，其对生物体胚胎发育、器官形成、左右对称、神经系统发生、体节形成、肢体发育和肾、胃肠、肺、牙齿的发育都有重要功能[2]。BMP还与肿瘤形成相关，可促进肿瘤侵袭和转移，支持肿瘤血管生成，抑制肿瘤微环境中免疫应答，诱导上皮-间充质转化[4]。

（2）BMP信号通路分为依赖Smad的经典途径和通过MAPK的非经典途径。当BMP分子结合I型受体或II型受体，受体激活型Smad（R-Smads，Smad1/5/8）在活化的受体胞内段丝氨酸/苏氨酸激酶作用下磷酸化，并与co-Smad (Smad4)形成复合体。R-Smads-co-Smad复合体转位入核，启动下游基因，如Id1, SnoN和SMAD6的转录[5]。（图1）

图1. BMP信号通路

2.BMP报告基因检测（BRE-Luc Reporter Gene Assay）的原理和应用

2.1 检测原理

Id1启动子序列是BMP信号通路的下游响应元件。报告基因质粒是将Smad结合元件Id1启动子序列装在荧光素酶启动子位置。一旦BMP-Smad通路被激活，报告基因就会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶的水平，可以高灵敏度地评价BMP通路的激活水平。

2.2 检测BMP通路水平

本检测是构建稳定转染报告基因的细胞系，评价药物对BMP依赖的Id1转录激活的抑制作用。加入BMP能够诱导Id1的转录激活作用，细胞中萤火虫萤光素酶的水平就会提高。而该报告基因细胞并不会对TGF-β有交叉反应。 该检测可以用于BMP通路激动剂或者拮抗剂药物的开发。（图2）

图2. BMP2特异性激活BRE报告基因

2.3 类器官培养核心蛋白Noggin的活性检测质控

Noggin是类器官培养过程中添加的一种核心蛋白。Noggin与骨形态发生蛋白结合可以协调 Wnt信号激活干细胞，促进其增殖，被广泛应用于各种类器官的长期培养，如肝脏类器官、小肠类器官及输卵管类器官。Noggin其作为转化生长因子（TGF）β超家族成员的细胞外负调节因子，可通过形成Noggin-BMP复合体特异性阻断BMP分子与其受体，包括II型受体（BMPR2、ActRIIa和ActRIIb）和I型受体（Alk1、Alk2、Alk3和Alk6）的结合，从而阻断BMP通路效应，调控细胞存活，增殖和分化[6]。加入Noggin能抑制BMP诱导的Id1转录激活作用。

本检测是构建稳定转染BMP通路检测工具，不仅可以用于BMP通路药物研发和评价，也被用于Noggin蛋白的质控测试。（图3）

图3. Noggin 拮抗BMP通路的激活

【参考文献】

1.Rasheed, N., et al., Atm-deficient mice: an osteoporosis model with defective osteoblast differentiation and increased osteoclastogenesis. Hum Mol Genet, 2006. 15(12): p. 1938-48.

2. Kuilman, T., et al., Oncogene-induced senescence relayed by an interleukin-dependent inflammatory network. Cell, 2008. 133(6): p. 1019-31.

3. Wang, R.N., et al., Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in development and human diseases. Genes Dis, 2014. 1(1): p. 87-105.

4. Ehata, S. and K. Miyazono, Bone Morphogenetic Protein Signaling in Cancer; Some Topics in the Recent 10 Years. Front Cell Dev Biol, 2022. 10: p. 883523.

5. Todd, G.M., et al., Secreted BMP antagonists and their role in cancer and bone metastases. Bone, 2020. 137: p. 115455.

6. Kang, H.W., R. Walvick, and A. Bogdanov, Jr., In vitro and In vivo imaging of antivasculogenesis induced by Noggin protein expression in human venous endothelial cells. Faseb j, 2009. 23(12): p. 4126-34.

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