干货分享 | 质粒抽提失败？质粒产量低？可能是这些原因

载体克隆是大多数基因递送实验的基础部分，也是初学者最容易遭遇挑战性问题的地方。即便是精心设计的、GC含量理想且不易生成特殊二级结构的载体，仍然会遇到克隆菌生长效率低、质粒产量低的问题，并且影响实验的最终成功。

影响克隆菌生长和质粒产量的主要因素有哪些？下面来看总结。

01 质粒的转化

为了将遗传物质递送到靶细胞中，第一步需要通过转化克隆菌来增加质粒的拷贝数。大多数标准步骤采用含有抗生素的LB平板来成功转化的细胞，使用的抗生素浓度因具体抗生素类型而异（表1）；例如，氨苄青霉素的推荐浓度为 100 µg/mL（对于包含低拷贝复制起点的质粒，建议浓度为 50 µg/mL）。

表1

另一种常用的筛选方法则是让质粒上携带有 lacZ 基因，然后依靠 β-gal 衍生物进行蓝/白筛选。筛选实验成功的关键是确保所有筛选试剂的功能并使用恰当。

此外，接种正确数量的细菌也至关重要——过多的细菌细胞将导致未转化的菌体也能生长，而接种量不足或过高的抗生素浓度则会阻碍生长。

存在多种因素会对细菌培养的效率造成影响，比如培养基组分、培养时间、培养体积等。转化后的细菌通常在SOC培养基中孵育，以促进转化后的细胞恢复。但是这种培养基的组分对于细菌生长来说并非最佳选择。在这种培养基中生长的细菌，其质粒产量远低于在LB中生长的细菌的质粒产量。

此外，我们的测试也表明，改变培养基中的抗生素浓度（100-150 µg/mL）对质粒产量的影响可以忽略不计。然而，准备新鲜的培养基很重要，这是因为抗生素，特别是氨苄西林，在液体培养方式中会快速降解。使用陈旧的培养基可能会导致不含质粒的细菌生长。

02 促进细菌增殖

提取质粒时，扩增不同拷贝数类型的质粒以及选择合适的纯化柱，一个重要的出发点是您所需要的质粒产量。

在质粒小提这样的小型纯化实验中，质粒产量是相对较低的：1-5 ml培养基过夜培养可以获得25 µg（高拷贝）或者12.5 µg（低拷贝）的质粒DNA。如果你需要更高产量的质粒，则应该采用质粒中提或者大提。

对于高拷贝质粒的纯化制备，建议使用100-150 ml的培养基进行质粒扩增，这样最多可产得500 µg的质粒DNA；对于低拷贝质粒，建议使用300-500 ml的培养基进行质粒扩增，这样可产得至多200 µg的质粒DNA。

需要注意的是，细菌数目饱和的菌液不应用于质粒提取，这是因为在这种菌液中的抗生素不仅发生了降解，而且质粒DNA也会因为细菌细胞死亡而丢失。如果培养时即将到达饱和而又无法及时提取质粒，则可将菌液离心，然后将沉淀的细菌储存在-80℃下以供后续使用。将原有体系中的菌液转移到更大体积的培养基中培养，可以进一步优化质粒DNA的产量。

此外，优化培养基成分也是改善质粒产量可行的方式，比如改变营养成分和糖源的比例。经测试发现，使用经过组分改良的LB培养基，质粒产量平均增加 57%（图1）。

图1 

使用组分改良后的LB与传统配方LB的质粒产量比较。12 ml体系对15个质粒进行了统计，500 ml体系对55个质粒进行了统计。每种LB体积的平均质粒产量齐一化为1。结果表明使用改良后的LB可以显著改善质粒产量。

相对于通用的优化策略，针对某些质粒本身可能还需要额外的培养条件优化。我们测试了55批次的细菌培养效果，每批均扩增一种独有的质粒（图2）。从结果上看，共50批质粒的产量通过使用我们改良后的LB培养基得到了增加，1批产量不变，4批则产量下降。

此外，即便培养条件相同，我们仍发现对于不同的质粒，其产量差异可达10倍以上。对质粒产量影响的因素可以是毒性基因，也可以是复制起点的序列特征、质粒大小、GC含量、特殊二级结构等问题。

图2 

55个质粒分别用500 ml LB测试细菌培养后的质粒产量。纵轴为使用改良后的LB后的质粒产量与使用传统LB后的质粒产量的比值。

03 从甘油菌复苏

大肠杆菌的长期稳定存储和运输通常采用甘油菌形式。从-80°C取出的甘油菌，在冰上解冻后，仅需要少量的样品即可接种2-5 ml包含适当抗生素的LB培养基。

使用甘油菌或者穿刺菌直接接种偶尔会遇到提取的质粒产量低的问题。对此，我们建议是首先将样品接种至包含适当抗生素的LB平板上划线培养，然后挑取该平板上的新鲜菌落再次接种培养。菌落可以采用酶切或Sanger测序法鉴定质粒特征。

如果以上方案均无法提高质粒产量，则可以考虑将质粒重新转化至新的感受态细胞，扩大培养后并再次提取质粒。注意该方式需要引入阴性对照。

04 质粒产量的重要性

获得高产量的质粒DNA对于基因递送实验至关重要。无论是质粒转染细胞、病毒包装，这些实验均对质粒DNA的产量有要求。

针对质粒提取实验中遇到的问题，可以从培养基优化、培养时间、培养体积等维度考量解决方案。

参考文献

1. Green R, Rogers EJ. Transformation of chemically competent E. coli. Methods Enzymol. 2013;529:329-36.

2. Wood WN, Smith KD, Ream JA, Lewis LK. Enhancing yields of low and single copy number plasmid DNAs from Escherichia coli cells. J Microbiol Methods. 2017 Feb;133:46-51.

3. Tachibana S, Chiou TY, Konishi M. Machine learning modeling of the effects of media formulated with various yeast extracts on heterologous protein production in Escherichia coli. MicrobiologyOpen. 2021 June;10(3):e1214.

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