防止PCR实验室气溶胶污染——热敏UDG酶应运而生

在PCR操作过程中，最容易出现“气溶胶污染”问题，实验室污染在阴性对照甚至空白对照中会出现假阳性的情况，使实验者无法对结果进行判断。

PCR实验室污染原因

01 样本间交叉污染

标本容器污染、标本密封不严、提取过程中加样枪污染。

02 PCR试剂的污染

频繁进出PCR的场所，样本管或阳性质控品被反复开盖，移液枪反复吸样等，形成气溶胶污染。

03 PCR扩增产物的污染

PCR产物拷贝量大，远高于PCR检测拷贝的上限，所以极微量的PCR产物气溶胶，就可能造成假阳性。

PCR实验室污染解决方案

上述提到的原因中，扩增产物的污染，是PCR反应中最主要的污染问题：

• PCR 扩增的放大倍数可以高达千万倍，而且在实际应用中，扩增一直在反复进行，会造成扩增产物的大量堆积，难于将其控制降解，即使是荧光PCR也很难避免扩增产物的污染。

• 气溶胶污染不能通过常规消毒消除，另外UV照射的去污染作用对500bp以下片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，通风去污耗时较长，容易死角残留。

为了使得PCR结果更加可靠、准确，有必要在反应管完全封闭后，于管内通过酶或其他方法，将操作过程中可能带人的残留污染物破坏清除，使其不能成为新一轮扩增的模板，从UDG酶的生物学特性可知，它是完成这一任务的不二之选。

热敏UDG酶在PCR实验室防污染中的作用原理

由正常碱基A、T、G、C构成的正常DNA，可以通过PCR反应，用dUTP代替传统的dTTP，扩增出大量含有尿嘧啶的DNA ( U-DNA )，是热敏尿嘧啶-DNA糖基化酶的有效底物；当扩增产物作为残留污染物时，它能通过UDG酶的水解作用，产生脱嘧啶嘌呤位点，该位点当进行PCR预变性时，DNA链在这些位点发生断裂，失去模板的功能，同时，通过预变性能够将反应体系中的UDG灭活，一方面有效的防止了残留污染物对PCR反应带来的污染，达到预防污染的目的，另一方面又有效地保护了新生扩增产物，完成新的PCR扩增。目前这一技术被广泛应用于在新冠核酸检测反应体系中。

热敏UDG酶的来源

热敏尿嘧啶-DNA糖基化酶(HL-UDG)是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的的重组蛋白。该UDG酶能有效地水解单链或双链DNA上的尿嘧啶，产生的缺嘧啶位点，在高温或高pH下，极易水解断裂。该酶对RNA无活性，主要用于PCR扩增产物的防污染。

大肠杆菌来源的尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG酶）较为耐热，经95℃10min处理仍会残留有少量的尿嘧啶-DNA糖基化酶活性，导致含有dU碱基的PCR产物的降解。热敏UDG酶与普通UDG酶相比，对温度敏感，可在50℃ 5min完全灭活，避免了常规UDG酶灭活后可能存在的残留活性在常温下对含dU扩增产物的降解作用。

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