JMT日本医疗——研究阐明防止多发性硬化症复发的重要分子机制

为什么有些病人没有复发？

10月11日，日本国立精神与神经医疗研究中心（NCNP）发表声明称，使用多发性硬化症（MS）的小鼠模型，探索了自身免疫性脑炎（EAE）反复复发决定是慢性化还是不复发的原因，明确了用于诱导EAE的肽和主要组织适合抗原类II分子（MHC class II）的结合稳定性是极其重要的因素。

该研究由该中心神经研究所免疫研究部研究员林幼伟、量子化学技术研究开发机构博士樱庭俊率领的研究小组完成。研究成果发表在《Journal of Autoimmunity》上。

MS是反复复发并逐渐恶化的难治性自身免疫性疾病，但也有即使发病时的病情很严重，之后也不会再复发的情况。在也有因频繁复发而留下高度障碍的情况下，关于为什么一部分患者不复发的基本疑问，至今还不清楚。

诱导EAE的肽的条件是？

EAE的症状和临床经过根据诱导使用的肽和老鼠种类的组合而不同。例如，给B6小鼠接种MOG 35-55肽后，诱导EAE出现进行性的、难以恢复的麻痹症状。另一方面，如果给SJL/J小鼠接种PLP139-151肽，最初的麻痹症状会恢复，但会反复复发。

最早证明PLP诱导EAE的是该中心的前身，国立武藏疗养所神经中心的田平武博士的研究小组，在美国通过对大量肽驱动膜的筛选，得出了PLP13发现了9-151的EAE诱导功能，而田平研报告了PLP136-150使用酶分解得到的蛋白质片段诱导EAE。虽然两者看起来序列几乎相同，但此次研究小组已经确认，用PLP136-150诱导的EAE完全不会复发。但是，时间在理由不明确的情况下流逝。

原因不在于小鼠的差异或诱导条件的差异，而在于肽序列的微妙差异。但是PLP136-150和PLP139-151是T细胞抗原受体（TCR）和MHC class推测II使用相同的氨基酸结合，不能理解只有一种肽引起复发性EAE。但是，对引发复发性疾病的肽和诱导暂时不复发疾病的肽的研究，不仅有助于理解自身免疫性疾病的慢性化，而且对理解肽的免疫原性（免疫反应的易感性）也很有意思。因此，研究持续了下来。

验证PLP136-150/PLP139-151诱导的EAE之间的差异

研究小组研究了由两种肽PLP136-150和PLP139-151诱导的EAE的差异。在PLP136-150中，在用诱导控制性T细胞的PLP136-150诱导的EAE恢复后，即使再次尝试用PLP肽诱导EAE，也绝对不会发生EAE。但是在PLP139-151诱导的EAE恢复期，PLP肽接种诱导了强EAE。PLP136-150诱导的EAE不会复发，对EAE的再诱导表现出抵抗性，这表明有强大的免疫控制系统在起作用。

因此，我们着眼于可控性T细胞（Treg）进行了研究。用PLP136-150诱导EAE后，注射具有清除Treg作用的抗CD25抗体，约一周后接种PLP136-150后，成功诱导EAE。这一结果表明，用PLP136-150免疫会强烈诱导控制性T细胞。

PLP136-150能强烈诱导抗原特异性Treg

研究小组进一步确认，PLP136-150容易诱导表达CD69和CD103的Treg，CD69+CD103+Treg具有较强的EAE抑制活性等。然后，由美国研究人员（内布拉斯加大学Jay Reddy教授）提供鉴定抗原特异性Treg的技术试剂（结合PLP肽的MHC class II dextranomer；PLP139-151/I-As dextramer），评估PLP139-151特异性T细胞的数量。用PLP136-150或PLP139-151诱导EAE约1个月后从淋巴结分离淋巴细胞或淋巴细胞进行分析，结果发现用PLP136-150诱导EAE时CD4+CD25+控制性T细胞中的PLP特异性T细胞的数量显著增加，PLP136-150具有较强的诱导抗原特异性Treg的能力。

接着将PLP136-150和PLP139-151的肽量减到原来的十分之一，诱导EAE，发现在这种suboptimal条件下，PLP136-150的EAE诱导功能很强。无论是诱导EAE的抗原特异性T细胞的诱导能力，还是抗原特异性Treg的诱导能力，PLP136-150都优于PLP139-151，推测通过抗原特异性Treg的诱导，EAE的复发将消失。

PLP136-150与MHC class II稳定地结合

研究小组对SJL/J小鼠的主要组织相容性抗原II类分子（MHC class II） I-As分子和PLP肽的结合稳定性进行了分析。通过分子动力学和replica exchange with solute tempering（REST）的数学计量计算，模拟了PLP肽/I-As分子复合物在溶液中的结构变化。分析结果表明，PLP136-150肽在MHC class II的凹槽（MHC groove）中保持稳定的位置，而PLP139-151经常处于从凹槽中弹出的不稳定位置。还证实肽的N末端是在MHC class II的凹槽外突出的残基（flanking residues）。由此，阐明了PLP136-150稳定地结合在I-As上的原理的细节。

多肽和MHC class II结合的稳定性很重要

PLP136-150通过与SJL小鼠的MHC class II分子I-As稳定结合，发挥了较强的免疫原性。当用PLP136-150致敏SJL小鼠时，脑炎引起性的抗原特异性T细胞也被强烈诱导，但由于优先诱导具有强活性的CD69+CD103+CD25high+CD4+Treg，EAE不再复发，EAE的再诱导也变得困难。相反，如果用不能稳定地与MHC class II结合的肽诱导自身免疫病，则认为疾病会慢性化而难治化。为了合成与MHC class II分子稳定结合的肽，不仅考虑与MHC class II的槽结合的氨基酸，还发现槽外的flanking residues的修饰也很重要。

研究小组表示：“在各种各样的免疫病和恶性肿瘤的多肽医药的开发上，期待这次的知识被活用。在对预防MS的疫苗存在争议的情况下，为了开发安全且有效的肽疗法，我们将继续进行研究。”

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