登上Cell：AlphaFold2助力冷冻电镜，从精子中发现影响其运动的全新蛋白

2023-10-24 10:09

该研究结合了高分辨率原位冷冻电子断层扫描电镜（cryo-ET）和AlphaFold2建模，并定义了一种视觉蛋白质组学方法，可以精确地将蛋白质放置在其天然细胞环境中，而无需标记，细胞破坏或纯化。

撰文丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

自然受精过程需要精子尾巴（鞭毛）有节奏的运动来推动自身向卵子移动。精子鞭毛的这种协调和重复弯曲依赖于大分子机制来产生周期性力和承受机械应力。目前，针对男性不育症的遗传分析只提供了精子中蛋白质候选者的不完整列表。此外，我们目前缺乏精子大分子复合物的高分辨率信息，以了解它们在分子水平上的组装和功能。

真核生物的运动纤毛和鞭毛共享一个保守的丝状结构，称为轴丝（axoneme），其特征是9个双微管围绕两个单微管的整体结构。值得注意的是，不同物种的精子在形态、功能和遗传学方面存在显著差异。特别是哺乳动物的精子鞭毛比其他运动纤毛更长更宽，能够承受更大的弯曲力矩。尽管精子轴丝在繁殖和物种形成中发挥着至关重要的作用，但我们对其独特适应性的了解仍然有限。

2023年10月20日，加州大学旧金山分校的 Zhen Chen、David Agard 等人在国际顶尖学术期刊 Cell 上发表了题为： De novo protein identification in mammalian sperm using in situ cryoelectron tomography and AlphaFold2 docking 的研究论文。

该研究将高分辨率原位冷冻电子断层扫描电镜（cryo-ET）和AlphaFold2结合，定义了一种视觉蛋白质组学方法，可以精确地将蛋白质放置在其天然细胞环境中，而无需标记，细胞破坏或纯化。研究团队使用该方法发现了Tektin 5、CCDC105和SPACA9是精子中新的微管腔内结合蛋白（MIP），并进一步阐明了Tektin 5的作用，Tektin 5缺失的精子运动能力较弱，具有更高比例的180°弯曲的畸形鞭毛。

从非精子运动纤毛中分离轴丝复合物，结合单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）分析，可以获得其高分辨率（优于4Å）结构信息。三级结构和侧链上丰富的结构信息使得在电镜结构重建中确定蛋白质身份成为可能。然而，还需要仔细优化纯化策略，以避免组分的部分损失。而纯化并不能保证获得真正完整的结构。另一方面，利用 冷冻聚焦离子束扫描电镜 （cryo-FIB-SEM）和原位 冷冻电子断层扫描电镜 （cryo-ET）直接可视化哺乳动物精子中的大分子复合物表明，哺乳动物精子确实具有特异性特征。

然而，目前基于cryo-ET亚断层扫描图重建的结构分辨率仅为10-20Å，主要原因是对齐不准确。在这种分辨率下，蛋白质的三级结构很少被解析，多蛋白复合物以斑点的形式出现，这使得确定单个精子蛋白质的身份具有挑战性。

在这项研究中，研究团队通过原位冷冻电子断层扫描电镜（cryo-ET）和亚断层扫描实现了小鼠和人类精子中轴丝微管结构平均高达6.0-Å分辨率的重建。

这一高分辨率的蛋白质三级结构使研究团队能够无偏倚地将精子特异性与21615个AlphFold2预测的小鼠蛋白质组蛋白结构模型相匹配。从中发现了Tektin 5、CCDC105和SPACA9是全新的微管相关蛋白。这些蛋白质形成一个广泛的相互作用网络，交联轴丝双微管的管腔，表明它们在调节轴丝的机械性能方面发挥作用。

研究团队进一步通过CRISPR基因编辑技术构建了Tektin 5基因敲除小鼠，结果显示，与正常小鼠精子相比，缺少Tektin 5蛋白的小鼠的精子运动能力更弱，精子鞭毛出现180°弯曲比例更高，这表明Tektin 5蛋白的缺失损害了精子鞭毛内细胞结构的机械完整性。

总的来说，该研究结合了高分辨率原位冷冻电子断层扫描电镜（cryo-ET）和AlphaFold2建模，并定义了一种视觉蛋白质组学方法，可以精确地将蛋白质放置在其天然细胞环境中，而无需标记，细胞破坏或纯化。使用该方法，研究团队发现了精子中几种新的 微管腔内结合蛋白 （Microtubule inner protein，MIP）的细胞内位置极其相互作用网络，并解析了它们促进鞭毛弯曲的机制。此外，这种视觉蛋白质组学工作流程还可能应用于其他细胞生物学问题，例如病毒的膜重塑和它们的原位相互作用物的鉴定。

论文链接：

https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(23)01038-3

题图为论文第一作者兼共同通讯作者 Chen Zhen

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微管,结构,精子,冷冻

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