收藏 l 非抗体支架蛋白的开发及其应用前景

1 引言

在生物医学研究和药物开发领域，我们经常需要从体液样本中分离和富集蛋白质，以进行进一步的分析。传统上，这一任务主要依赖于抗体或免疫球蛋白来实现。然而，抗体存在如成本高昂、生产周期长、免疫原性等不足之处。因此，科研人员积极寻求创新的非抗体支架蛋白，以弥补这些缺点。

非抗体支架是一类基于不同蛋白质支架的结合分子。它们通常通过噬菌体展示、酵母展示或其他展示技术进行选择和优化。这些技术使研究人员能够从大量不同的分子中筛选出具有高结合亲和力的binder，从而实现对蛋白质的高效富集。

本文将重点关注在富集蛋白质，进行液相色谱质谱（LC-MS）分析时的几种非抗体支架，并将它们与抗体进行比较。此外，我们还将简要介绍binder的固定方法。

2 抗体类支架

2.1 抗体

抗体具有恒定区域和可变区域，其中可变区域包含抗原结合位点，而恒定区域决定抗体的效应功能。目前最常用的抗体是单克隆抗体，可以通过适当动物的免疫后，利用杂交瘤技术或DNA重组技术在哺乳动物细胞系中制备。

2.2 抗体结合片段（Fab）

Fab是一种抗体片段（约50 kDa），每个片段包含轻链和重链的一个恒定区域和一个可变区域，可通过使用Papain，IdeS或GingisKHAN™等限制性蛋白水解法制备，这些酶在铰链区域或附近切割；相应的序列也可以克隆并在哺乳动物细胞系、酵母或大肠杆菌中表达。

Fab可以通过分子内二硫键连接两个Fab，形成(Fab’)2。而(Fab’)2具有两个结合位点，它们都不包括抗体的Fc部分，因此不能执行效应功能。

2.3 单链可变片段（scFv）

scFv由抗体的轻链和重链各自的两个可变片段（约25 kDa）经肽链连接而成，通过DNA重组技术在酵母或细菌细胞中表达。

2.4 重链抗体（HcAbs）

HcAbs是最初在骆驼中发现的抗体（约75 kDa），属于重链抗体，它们没有轻链，抗原结合位点由重链的一个可变区域决定。HcAbs可以通过免疫适当动物后的杂交瘤技术、噬菌体展示技术或重组DNA技术在哺乳动物细胞中表达。

2.5 纳米抗体（Nbs）

纳米抗体由HcAb的一个可变区域定义，是最小的抗体类支架（约15 kDa）。Nbs可以通过重组DNA技术在细菌、哺乳动物细胞系或植物中表达。

虽然抗体类支架作为捕获剂取得了重要成就和成功，但也遇到了一些问题：

抗体的生产过程复杂、昂贵，且存在批次间差异，在固定化（附着到表面）过程中可能丧失与目标抗原结合的能力。

相比抗体而言，Fabs和scFvs对目标的亲和力会低些，其中Fabs固定化与scFvs稳定性存在一些不确定性。

HcAbs和Nbs的抗原结合位点仅有一个可变区域，在结合方面受到一定限制。

这些问题促使研究人员开发替代的非抗体支架，希望既保留抗体支架特异性和高亲和力的优点，又避免上述缺点。

3 非抗体支架概述

3.1 核酸适体（寡核苷酸或多肽）

基于寡核苷酸或多肽结构的核酸适体具有与抗体相媲美的特异性和亲和力。其寡核苷酸的大小范围约为5-30 kDa，可通过配体指数富集的系统进化技术（SELEX）进行靶向选择；多肽核酸适体由随机多肽序列的稳定蛋白质binder构成，可以通过酵母或噬菌体展示技术进行筛选。

3.2 DARPins（设计的锚蛋白重复序列）

DARPins由14-18 kDa大小的锚定重复序列蛋白组成，这些重复序列蛋白组装在一起形成重叠的结合表面。DARPins通过噬菌体或核糖体展示获得，也能够在大肠杆菌中表达。这种蛋白即使在高浓度下也不易发生聚集，它们最初的生物学功能是选择性地结合靶蛋白。

3.3 非抗体纤维蛋白原结合蛋白（Affimers）

Affimers是人类蛋白酶抑制剂stefin A或phytocystatin构成的蛋白质binder，大小约为12-14 kDa，包含两个可变的结合环，其结构由四个β-折叠片和一个α-螺旋组成。

Affimers可以通过噬菌体展示技术进行修饰，以靶向不同的目标。

3.4 Knottins

Knottins是基于抑制剂半胱氨酸结环（ICK）binder的小型蛋白质，大小约为4 kDa，可以通过化学合成或酵母展示制备。其结构中一个二硫桥通过肽主干形成环框架，与另外两个二硫桥形成结状结构，具有高热稳定性和蛋白酶稳定性。

3.5 Avimers

根据不同细胞表面受体的保守A结构域，的平均体大小约为4 kDa。激活蛋白能够结合同一靶标上的不同位点，甚至同时结合不同靶点的蛋白质。通过噬菌体展示筛选最佳结合物后，可以在大肠杆菌中大量表达激活蛋白。

3.6 Monobodies

Monobodies是由人类纤连蛋白类型III结构域（FN3）生成的结合蛋白，大小约为10 kDa。这种蛋白可以通过噬菌体或酵母展示筛选，并在大肠杆菌中高效表达。

3.7 Anticalins

Anticalins是脂质蛋白结构的20 kDa蛋白质结合片段，可以通过噬菌体展示筛选后在大肠杆菌中表达。

3.8 Fynomers

Fynomers是从人类酪氨酸激酶Src Homology 3（SH3）结构域获得的结合蛋白，大小约为7 kDa。Fynomers通过噬菌体展示筛选后在大肠杆菌中表达。

3.9 Affibodies

Affibodies是基于三螺旋束Z结构域的结合蛋白，大小约为7 kDa，可以通过化学合成，或噬菌体展示筛选。

这些非抗体支架具有不同的特性和应用潜力。在液相色谱质谱（LC-MS）分析中，非抗体支架与抗体相比也具有一些优势。

首先，它们更容易与质谱仪器兼容，不会引入额外的干扰和误差。其次，它们通常体积较小，这有助于减小样品体积和浓缩效应。最重要的是，它们可以特异性地富集目标蛋白质，减少了背景干扰。

4 噬菌体展示技术

由于许多非抗体支架是通过噬菌体展示或类似的展示技术来筛选的，因此简要介绍这种方法。

噬菌体展示技术是利用基因重组的方法，将目标蛋白的基因重组到噬菌体衣壳蛋白的基因上，最终将目标蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面。

为了使用噬菌体展示筛选binder，需要进行生物筛选。生物筛选的步骤包括将噬菌体库暴露在一个目标上，然后进行多次洗涤、洗脱和扩增，以获得最适合该目标的结合物。图3为生物筛选过程中所涉及的步骤。

5固定方法

将binder固定在表面以限制其位移称为固定。迄今为止，大多数富集程序都是将binder固定在表面上。重点环节是，固定binder不应干扰其与目标蛋白的结合，否则可能导致目标蛋白的回收减少。

5.1 物理吸附

·利用蛋白质通过静电作用、氢键、偶极-偶极或疏水相互作用等分子间力量吸附到表面的能力。

·尽管物理吸附是最简单的方法，但无法控制binder的定位，而且某些蛋白质（如抗体），可能变性并失去结合能力，必须仔细控制以避免再现性问题，特别是在需要定量结果时。另一个风险是，物理吸附在富集过程中可能会被部分洗脱，因此，在(LC)-MS测定中通常不采用这类方法。

5.2 共价固定

·蛋白质中暴露的侧链上的官能团与表面固定的官能团之间形成共价键，在（LC）-MS测定中起着重要作用。

·蛋白质上有一些官能团可以用于固定，如-COOH，-SH和NH2官能团，以及表面上的活化官能团或活化剂。

·binder上的混合官能团可能随机结合，导致定位出现错误。然而，如果binder上的特异性反应性官能团位于其目标位点上，固定将避免这种情况，使其具有选择性。

·化学合成或遗传密码重编程可以引入包含此类官能团的氨基酸。

5.3 亲和固定

·这种固定方法涉及binder和相应表面之间的亲和性相互作用，binder可能需要进行编辑以适应。

·生物素与链霉亲和素的相互作用，His-tag与Ni2+离子的相互作用，或者蛋白A/G与抗体的Fc区域的相互作用常用于非共价的、基于亲和的固定。

·由于亲和相互作用通常强且具备特异性，所以将binder从表面上洗脱的风险较低。与其他方法相比，亲和固定更加温和，并且由于binder可以分离并重新固定，固定面可以多次重复使用。

·采用这种方法时，需要考虑如何从固定的binder中洗脱和回收结合的目标蛋白。通常在低pH等变性条件下进行，或直接分解表面上捕获的蛋白质，以获取LC-MS分析所需的特征肽。

·亲和固定更具定量性，但它的缺点是通常会产生来自过量固定的binder的肽段。这通常不会影响LC-MS定向测定，因为目标特征肽可以根据m/z值、裂解谱和保留时间与其他肽段区分开。当需要更温和的洗脱条件时，可以将binder以共价方式固定，然后基于特定的化学反应回收目标蛋白。

6 非抗体亲和富集结合质谱

虽然抗体富集仍然是最常用的蛋白质富集方法，但一些例子表明，非抗体支架亲和富集方法在部分定量分析中具有更好的效果。

将Affimers对白细胞介素37（IL-37）和前胰岛素的富集效果，与抗体进行比较。研究表明，Affimers能够比商业化的单克隆抗体更有效地富集前胰岛素。Affimers也被用于研究慢性阻塞性肺疾病（COPD）中潜在的肺气肿发展生物标志物，以及可溶性高糖基化终末产物受体（sRAGE）的定量。研究结果显示，与使用抗体的方法相比，使用Affimers富集的sRAGE的浓度更高。

Radko等人利用寡核苷酸适体从血浆中富集重组SMAD4蛋白。SMAD4是一种肿瘤抑制因子，通过介导TGF-β信号通路来控制上皮细胞的生长，与胰腺癌和结肠直肠癌有关。在SRM模式下用LC-MS进行分析，结果表明，与血浆内直接酶解相比，在富集SMAD4后的浓度灵敏度提高了1.5个数量级。

Ngo等人使用一组核酸适体来定位心血管疾病的生物标志物。他们成功地富集了血浆中的目标蛋白质，并通过SRM进行了分析。而Gupta等人比较了核酸适体和抗体富集从血浆中捕获重组PCSK9的能力。结果显示，核酸适体具备与抗体相当的水平。

Lee等人使用基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）研究了核酸适体和抗体用珠体固定时对凝血酶的亲和富集。结果显示，核酸适体法产生更多的凝血酶源肽段，并减少了背景干扰。此外，核酸适体可以检测到更低浓度的凝血酶。

图5.基于抗体的（a, b）和基于核酸适体的（c, d）亲和富集方法之间的MALDI-MS光谱比较

这些研究表明非抗体支架亲和富集法在蛋白质富集以及与质谱分析结合方面具有极大的潜力，并在某些情况下表现出与抗体相当，乃至更加优越的性能。

7 结论

非抗体支架开启了一个充满前景的领域，用于体液样本中蛋白质的富集和LC-MS分析。它们具有许多优势，包括较低的成本、更简单的生产工艺、较低的免疫原性和更广泛的适用性。然而，要充分发挥它们的潜力仍需不断探索。

在未来，我们可以期待看到更多非抗体支架的开发和优化，以满足不同领域对蛋白质分析的需求，特别是在蛋白质定量分析和治疗性生物指标监测方面。这将为生命科学领域的进一步研究和创新提供有力的工具和资源。

关于古格尔生物

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成都古格尔生物，是一家专注生物大分子，做有价值的抗体分子（scFv、Fab、sdFv、VHH、双抗）和类/非抗体支架蛋白分子（TCR、Affimer等）研发服务的生物高科技企业。公司拥有自主研发的万亿级超大容量天然全人源scFv/Fab/sdFv抗体库，总库容约：2x10E12 cfu、300峰天然骆驼纳米抗体库，千亿级，总库容约：2x10E11 cfu、Camel+Alpaca+Llama组合式免疫纳米抗体研发平台、TCRm分子库，类/非抗体支架蛋白分子合成库、组合式药物分子筛选平台、表达评价平台等，一站式为客户提供创新药物Lead先导分子和PCC分子。

参考文献

[1] Olaleye, Oladapo, Natalia Govorukhina, Nico C. van de Merbel, and Rainer Bischoff. 2021. "Non-Antibody-Based Binders for the Enrichment of Proteins for Analysis by Mass Spectrometry" Biomolecules 11, no. 12: 1791. https://doi.org/10.3390/biom11121791.

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