一文带你了解mRNA应用的功臣——脂质体

随着新冠疫情大爆发，mRNA疫苗的概念深入人心，然而十年前mRNA的实际应用还远远看不到希望。在通过将假尿嘧啶核苷引入mRNA解决了mRNA强免疫原性和LNP递送解决mRNA自身不稳定、易降解、不容易进入细胞的两大难题后，2015年后mRNA的药物发现及应用迎来了快速发展。

信使RNA (mRNA) 是蛋白质生物合成的模板。天然mRNA由5′非翻译区（5′UTR）、开放阅读框（ORF）和3′非翻译区（3′UTR）组成（如图1所示）[1]。mRNA 通过 ORF 中的密码子引导核糖体上的蛋白质生物合成。体外转录的 mRNA (IVT mRNA) 具有相似的结构。将外源 mRNA 输送到细胞中可以立即准确地生成蛋白质且没有基因组诱变的安全风险，为基因治疗提供了一种替代方案。对于肿瘤及相关感染性疾病，IVT mRNA可以翻译相应抗原，激活或增强特异性免疫，预防感染性疾病或增强肿瘤免疫。

 🔼图1.mRNA结构示意图

脂质载体可以保护 mRNA 免受酶促降解，且封装效率高，一些脂质在生理环境中带正电，并且可以静电涂覆带负电的mRNA，从而使递送系统能够与目标细胞膜很好地结合。脂质载体在药物递送方面至今已有60多年的发展历史，用于mRNA递送的脂质载体可分为多种类型，包括脂质体（LPs）、类脂质纳米粒子（LLPs）、固体脂质纳米粒子（SLNs）、纳米结构脂质载体（NLCs）、脂质聚合物杂化纳米粒子（LPNs）、纳米乳液、外泌体和脂蛋白颗粒 (LPT) 。最近一篇研究[2]总结了脂质载体的特征及其在 mRNA 递送中的用途，不同脂质载体的结构如图2所示。

🔼图2. 各类mRNA递送脂质体

其中明星脂质载体当之无愧是LNP，脂质纳米颗粒 (LNP) 已被用作信使 RNA (mRNA) 疫苗的载体。LNP 的表面特性对于 mRNA 疫苗的稳定性和功能很重要。聚乙二醇 (PEG) 是 LNP 表面的功能性脂质，可提高胶体稳定性、增加循环时间并影响细胞摄取[3]。来自辉瑞的研发人员利用高场核磁共振 (NMR) 光谱深入探索 mRNA-LNP 表面的脂质组成。目前用于 Pfizer-BioNTech 和 Moderna COVID-19 mRNA 疫苗的 LNP 含有四种不同类型的脂质：可电离脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇和辅助脂质[4]。LNP 表面的聚乙二醇化脂质是一种特殊的功能性脂质，可提高胶体稳定性、增加循环时间并影响细胞摄取。该研究的结果表明 1D 1核磁共振氢谱是全面、快速表征 mRNA-LNP 结构特征的重要技术。首先，NMR 可以表征用于制造 LNP 的单个脂质，可以确定 ALC-0159 中 PEG 链的分子结构和分子量。对于 COMIRNATY mRNA-LNP，NMR 检测到表面上的 PEG 链，正如预期的那样，可改善颗粒稳定性和疫苗功能，并且部分 ALC-315 可电离脂质靠近 LNP 表面，从而调节表面电荷。使用定量质子 NMR 数据可以准确测定 PEG 密度，结果表明，LNP 在表面表现出致密的 PEG 刷状构象（如图3左下所示结构）。

 🔼图3. 表面 PEG 模型和 COMIRNATY mRNA 脂质纳米颗粒组合物。

( A ) 表面 PEG 构象的两种主要模型：蘑菇状和刷状。

( B ) COMIRNATY脂质纳米颗粒组合物。

COMIRNATY 疫苗药物产品由 LNP 封装的 mRNA 分子组成，被用作 NMR 表面表征的案例研究。LNP 含有聚乙二醇化脂质 (ALC-0159)、可电离脂质 (ALC-0315)、磷脂 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DSPC) 和胆固醇（见图 3 B) 以规定的比例混合以促进稳定纳米结构的形成。

当mRNA脂质纳米颗粒进入体内时，会经历吸收、分布、代谢和排泄等生物过程。尺寸和表面电荷显着影响 mRNA 脂质纳米粒子的吸收。小于10纳米的颗粒可能会从疏松的淋巴管中逸出并积聚在脾脏中[5]，而大于100纳米的颗粒则难以扩散到毛细淋巴管中。因此，尺寸为10-100 nm的颗粒在靶向淋巴结时更有效。另外，淋巴结中的胶原纤维、糖胺聚糖等成分带负电，因此，中性或带负电的 mRNA LNP 总是用于淋巴递送。

由于肝脏积聚，mRNA 脂质纳米粒子的治疗潜力有限。最近的研究结果表明，用器官选择性蛋白修饰的 mRNA 脂质纳米粒子可以将药物递送到肝脏以外，这主要取决于蛋白质特性。mRNA 脂质纳米粒吸附血液中的血清蛋白并被靶器官上的受体识别。

因此，mRNA 脂质纳米粒子可以被设计为针对特定器官，例如肺和脾。代谢和消除也是 mRNA 脂质纳米粒子在体内命运的关键步骤。高生物降解性对于确保使用时的安全至关重要。有研究报道了一种新型可电离脂质，DLin-MC3-DMA5，通过在脂质中引入酯键来增加其降解安全性。其体内实验表明，DLin-MC3-DMA5给小鼠静脉注射后72小时内迅速代谢并通过尿液和粪便消除。

总而言之， mRNA递送的有效性在于以下几个方面：1）mRNA/载体复合功效决定了mRNA的降解；2) 适度的结合强度使得递送系统能够在目标目的地释放mRNA；3) 有效的细胞摄取和膜融合释放。因此，具备这些标准的脂质载体可以有效地递送mRNA，未来应该付出额外的努力来获得更加有效的 mRNA 传递载体。

Ref：   [1]. P. Midoux, C. Pichon. Lipid-based mRNA vaccine delivery systems. Expert Rev Vaccines, 14 (2015), pp. 221-234   

[2]. Zhang W, Jiang Y, He Y, Boucetta H, Wu J, Chen Z, He W. Lipid carriers for mRNA delivery. Acta Pharm Sin B. 2023 Oct;13(10):4105-4126. doi: 10.1016/j.apsb.2022.11.026. Epub 2022 Nov 30. PMID: 37799378; PMCID: PMC10547918.   

[3]. Wang MM, Wappelhorst CN, Jensen EL, Chi YT, Rouse JC, Zou Q. Elucidation of lipid nanoparticle surface structure in mRNA vaccines. Sci Rep. 2023 Oct 5;13(1):16744. doi: 10.1038/s41598-023-43898-x. PMID: 37798336; PMCID: PMC10556076.   

[4]. Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation (Aug, 10.1038/s41573-021-00283-5, 2021). Nat Rev Drug Discov2021,20(11), 880–880.   

[5]. G.M. Ryan, L.M. Kaminskas, C.J. Porter. Nano-chemotherapeutics: maximising lymphatic drug exposure to improve the treatment of lymph-metastatic cancers. J Control Release, 193 (2014), pp. 241-256.