NDv | 基于Nbs的化疗药物递送载体

基于Nb的药物载体（Nb-based drug vehicles，NDv）

近年来，针对肿瘤的靶向治疗方法不断取得突破性进展。其中之一便是基于Nbs的化疗药物递送载体（NDv）。与纳米抗体偶联药物（Nb drug conjugates ，NDCs) 略有不同，NDv是一种将纳米抗体修饰到纳米药物载体上（如脂质体、胶束、白蛋白及铁蛋白类的纳米颗粒和聚合物类多聚体等），利用纳米抗体结合特定抗原，对肿瘤细胞实现靶向治疗的策略。NDv所具有的高靶向性、药物保护性、控药释放性以及组织渗透性，使其能实现更精确、有效和安全的药物传递和治疗。

图1. mAb和Nbs偶联到基于纳米技术的药物传递载体（NDv）的示意图表示，较小尺寸的Nbs提供了更均匀的附着。

图中显示了两种不同的结构：一种是连接了mAbs的脂质体，另一种是连接了Nbs的脂质体。mAbs相对较大，可能有更多功能性活性基团附着到NDv上，导致连接点不均匀，而Nbs的较小尺寸则使得连接更为均匀。最终，mAbs或Nbs的取向可能影响其对癌抗原的亲和性或识别能力。

NDv的优势

基于纳米抗体的药物传递载体（NDv）与使用mAb的递送载体相比，Nbs的小尺寸增加了载体（NDv）的稳定性和控制取向。而与NDC相比，NDv的载药能力方面有更大的效率。另外，NDv内部的自由体积可装载不同尺寸，亲水或疏水类型的药物分子，通过NDv与某些分子的适应或修饰可以调节ADME（药物在体内的吸附、分布、代谢和排泄过程）从而显著改变药代动力学，可有效降低附着药物的副作用（与健康细胞的非特异性相互作用、低稳定性、冠状蛋白形成、免疫攻击、药物泄漏和可重复性），且能大大提高药物靶向效应和治疗效果。

NDv不仅仅可以用于传统的化疗药物递送，还可以与其他新型治疗策略相结合，如免疫疗法、基因治疗等，形成多重疗法的联合治疗方案。这种综合治疗策略可以有效地消除癌细胞的耐药性，降低化疗药物对健康组织的损伤并提高药物的抗肿瘤效果，为患者带来更精确、有效和可持续的抗癌治疗方案。

1.免疫疗法联合化疗：NDv可被设计为靶向免疫检查点抑制剂或免疫刺激剂的递送系统。通过将免疫疗法药物结合到NDv上，并使用靶向分子实现肿瘤细胞特异性的递送，可以提高药物在肿瘤区域的浓度，增强免疫疗效。

2.基因治疗联合化疗：NDv可以将基因治疗药物如siRNA、mRNA等递送到肿瘤细胞内部，以实现基因靶向治疗。与化疗药物联合应用时，可以发挥协同效应，增强治疗效果。

3.光热联合化疗：NDv具有良好的光热转换性能，可用于光热治疗。通过将光敏材料修饰到NDv表面，将这些NDv导向肿瘤区域，并在外部光源的作用下释放热能，达到灼伤和杀死肿瘤细胞的效果。与化疗药物联合应用时，可以实现光热治疗与化疗的双重优势。

4.放射治疗联合化疗：NDv可用于放射治疗的增敏剂。通过将放射敏感物质结合到纳米粒子上，可以实现放射治疗剂量的加强，同时减少对正常组织的损伤。与化疗药物联合应用时，可以发挥放射治疗与化疗的协同作用。

图2. 利用能在肿瘤环境下发生构象变化或水解的生物相容材料制备NDv，从而对其药物释放机制进行控制。由于EPR效应使NDv能够渗透到肿瘤部位。一旦到达肿瘤部位，NDv将释放药物，释放机制受到内部和外部刺激的影响，具体取决于用于开发新型NDv的材料。

EPR（Enhanced Permeability and Retention）效应是指在肿瘤组织中相对于周围正常组织，血管壁的通透性增加，导致大分子药物和纳米粒子更容易进入肿瘤组织的现象。这是肿瘤组织特有的生理现象之一，通常被用于癌症治疗中，尤其是用于肿瘤靶向治疗。

NDv在肿瘤治疗中的研究进展

较为前沿的NDv构建策略包括：聚合物胶束(PMs)、树状聚合物纳米颗粒、纳米尺寸的DNA运载体(TET)、荧光上转换纳米颗粒(UCNPs)、白蛋白纳米颗粒、脂质体。

脂质体是微小的球形囊泡，内部是水核心，外部由脂质双分子层包围。它通常由不易引起免疫反应的自然两性磷脂和胆固醇构成，大小可控，具有良好的亲水性和疏水性。这使得脂质体成为一种理想的化疗药物传递系统。纳米抗体可以结合到脂质体上，形成纳米抗体-脂质体复合物，用于靶向药物传递。

研究表明，使用脂质体结合的EGa1纳米抗体（即EGa1-L）能够选择性地识别EGFR，并诱导超过90%的受体下调(a-ii)。EGa1-L引发的大规模EGFR封闭作用可持续至少3天，导致EGFR降解(a-iii)。相比之下，使用EGa1纳米抗体的单价形式未观察到这种效果。在体内实验中，EGa1-L在快速增殖的14C异种移植瘤中显著抑制了肿瘤生长(下图b-ii)，而在生长较慢的MB-468异种移植瘤中效果不显著(下图b-iii)。这表明了在设计纳米药物传递系统时，预先筛选目标蛋白的表达水平和验证患者肿瘤活检标本的突变状态的重要性。

图3. 多价Nb-脂质体平台的示意图。

聚合物胶束（Polymeric micelles，PMs）是两亲性分子的纳米级复合物，它们自发地在水溶液中组装成载体，可用于装载化学药物或其他抗癌药物。PMs由于其宿主良好的特性：生物相容性、增强的稳定性、溶解不溶性药物的能力以及在血管受损的病理区域的积累，引起了人们的广泛关注。研究表明，抗EGFR Nb（7D12）与基于InP/硫化锌量子点（QD）的治疗胶束，即装载化学药物氨基黄酮（AF）的QD-PLA-PEG胶束，与没有Nb相比，在靶点的积累提高了67倍。将装载QD的Nb偶联胶束静脉注射到小鼠肿瘤模型中，并在处理5h和24 h后记录荧光发射。同时观察到含Nbs（AF-T）的AFmicelle组（绿色标记）肿瘤的生长显著降低。

图4. 与纳米抗体7D12结合的QD-PLA-PEG胶束（NDv）的合成示意图。(ii)非靶向胶束（小鼠1、2和3）和靶向QD-PLA-PEG胶束（小鼠4、5和6）的体内荧光图像。白色箭头表示肿瘤部位有无Nbs的共轭胶束的荧光强度有显著差异，有Nbs的胶束表现出增强的生物成像性能。(iii)基黄酮封装的纳米抗体靶向胶束（AF-T）可以有效地消退肿瘤。

树状聚合物纳米颗粒（Dendrimers）是一种由一系列径向对称分支单体构成的聚合物纳米颗粒，具备可控合成、良好溶解性、高生物相容性、多价外表面和长期稳定性等优点。因此，在靶向癌症治疗中，药物装载方面它被认为是理想的候选结构。Wu等人（2020年）提出了一种将NDCs与NDv结合的新方法，利用树突状纳米颗粒与抗EGFR纳米抗体（7D12）结合，形成聚集的NDCs来输送四价铂（Pt（IV））前药。这些聚集的NDCs（cNDCs）是通过聚乙二醇化的树状多赖氨酸（PEG-DPK）和抗原抗体（Nb）的Q标签进行位点特异性结合形成的，通过转麸胺（mTGase）介导的连接完成。随后，马来酰亚胺基团功能化的Pt（IV）前药分子与Nb的巯基结合形成团簇。cNDCs在受体介导的细胞内吞作用后内化，前药分子在细胞内还原过程中激活为活性形式（Pt（II）形式），导致DNA以时间依赖的方式铂化。

图5. 构建cNDC@PEG并针对EGFR阳性癌细胞的示意图。

研究人员系统地证明了cNDC与单线态NDC形式相比的抗癌效率。体外研究表明，cNDC制剂对EGFR过表达细胞的抗增殖活性增强，在体内研究中，还观察到半衰期的增强，这可能是因为血液保留能力的增强，降低了肾脏清除率。与单线态NDC或药物相比，这种治疗方案即使在单次静脉治疗后，也可观察到肿瘤区域cNDC的积累增强。

图6. b)在注射cNDC@PEG、NDC@PEG或顺铂后肿瘤区的铂（Pt）含量。c) 免疫荧光染色图像，用于了解肿瘤内部的穿透情况（细胞核用DAPI染成蓝色；血管用Cy5标记的抗CD31抗体染成红色；PEG化纳米抗体用FITC标记成绿色）。d) 不同组别（标有A431（++）的）在体内对A431肿瘤的抗癌效果。

纳米尺寸的DNA运载体(TET）

DNA分子通过互补结构域序列的杂交，可以定制设计以形成纳米级的折叠结构。这种结构可用于装载化学药物或针对靶细胞的治疗剂，并且可以编程以触发生物微环境中的细胞作用。Wu等人（2019）设计了一种双束四面体形DNA载体（TET），偶联到抗-EGFR Nbs上，通过DNA载体的插入，用于递送铂基DNA插入器56MESS（亲水性铂（II）基DNA插入器）。TET被设计为在肿瘤微环境中释放56个MESS，并阻断癌细胞中EGFR受体的信号转导。

图7.用于靶向铂类药物递送的Nb偶联DNA纳米平台示意图（TET，双束DNA四面体；Nb-TET，Nb偶联双束DNA四面体；Nb-TET-56MESS，铂类载药NbTET）。

研究人员系统地设计了不同的治疗组，体外细胞毒性分析结果发现，与其他组相比，Nb-TET表现出更强的抗癌作用。肿瘤异种移植模型显示治疗6h和12 h后NDv的积累增加。

b)不同组A431细胞体外细胞毒性评价，孵育48小时。c）使用Nb-TET-56MESS系统治疗后1至12小时内瘤内铂含量。

结语

将药物与基于纳米抗体的载体结合（即NDv）是一种一种新兴的药物输送系统，突破了化疗的限制，实现了对癌细胞的精准传递，大幅减少了副作用。纳米抗体（Nbs）的纳米级尺寸、高溶解性、稳定性、低免疫原性、深入肿瘤穿透能力、卓越的特异性以及对癌症生物标志物的高亲和力等独特特性，使其成为理想的靶向分子。

深入了解纳米抗体与癌症生物标志物/抗原的相互作用对于充分发挥NDC或NDv在化疗中的潜力至关重要。展望未来，随着对基于Nb疗法投入的不断增加和更多团体的研究，我们期待基于纳米抗体的药物在不同治疗和诊断应用领域得到广泛的实际开发和应用。

参考文献：

Panikar, Sandeep Surendra et al. Nanobodies as efficient drug-carriers: Progress and trends in chemotherapy. J Control Release. 2021 Jun 10;334:389-412. doi: 10.1016/j.jconrel.2021.05.004.

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