多重PCR技术研发的个人感悟和思考！

2023-10-12 19:21

在我们设计多重引物PANEL时候，应该选择：合适GC含量（如50-60）的靶向区间；如果为了提高靶获的成功率，可以选择多拷贝的区间，能够大大的提高扩增成功率。

来源：科研入门狗

我个人研究多重PCR技术最开始是在2019年，基于多重PCR技术用于扩增子建库，在一管内实现目标捕获和文库构建工作。如今的工作重点是开发超多重PCR技术应用于病原菌的检测工作。

这几年的技术开发工作，几乎都是个人闭门造车，与其他公司和科研单位的交流学习，也都是点到为止，对整个多重PCR技术的研发和升级工作没有啥实质帮助。我不晓得这种局面是不是对于整个行业的发展是否有利，但是对于每个技术研发员来说，太痛苦了，每一步都需要自己去踩坑和试错，背负着巨大的压力。因此创建了一个多重PCR技术讨论群，希望大家可以在自己的能力范围内，能给点帮助就给点帮忙，让技术研发员和硕博生等这些一线的工作人员，能少走点弯路，减轻点压力，有勇气继续坚持下去。回归正题，我分享下这几年的一些研发经验。

靶标的选择

引物对于不同序列的扩增效率差异可谓巨大，如下图，对于一个病原设计了不同的靶标区间，去捕获，测序获得的不同reads数。左列是不同的引物对（不同的目标区间），右侧是测序获得的reads数，最好的区间可以获得4万多条reads，最差的只有66条，相差了100多倍。这么悬殊，如果研究起来影响因素太多。后面，我认为是目标片段的长度和GC含量影响较大。

因此设计了3种不同GC的片段，进行混池PCR扩增测序，也基本可以验证了我的想法，最好扩增的就是你设计最合适的GC含量。如下图，NC_E是最合适的GC含量。

因此，在我们设计多重引物PANEL时候，应该选择：合适GC含量（如50-60）的靶向区间；如果为了提高靶获的成功率，可以选择多拷贝的区间，能够大大的提高扩增成功率。

二聚体的问题

二聚体问题是多重PCR的拦路虎，最简单的方法其实就是加大模板投入量，因为引物总是优先扩增目标序列。但是过多的模板投入，会带来非特异性扩增，因此思考的问题，就是二聚体和非特性产物两者的抉择问题，二聚体无法避免，只能降低到一个可接受的范围即可。但是模板投入过多，也会带来扩增抑制的情况，因此二聚体的解决思路，可以模仿HANDS的方法。

PCR污染问题

PCR污染问题，是PCR实验最难克服的问题。一旦污染，几乎很难挽救。因此前期工作必须细致，尽量减少开盖，划定区间，定期消杀。