银杏内酯注射液有望成为阿尔茨海默症治疗的新选择

银杏叶(Ginkgo biloba, GB)提取物作为一种植物性药物，因其具有抗氧化、抗炎、抗过敏、清除自由基、抑制血小板聚集等多种生物和药理活性而被广泛用于治疗脑血管疾病。有趣的是，最近的几项研究表明，GB提取物对痴呆症也有一定的治疗作用。鉴于这些发现，GB提取物已被推荐用于治疗AD患者，特别是那些未能从其他治疗中获益的患者。目前银杏提取物的国际标准为EGb 761，含有两种主要活性物质:黄酮类苷(24-26%)和萜烯内酯(6-8%)，由银杏内酯A、B、C和白果内酯组成。此外，基于技术进步，银杏内酯注射液是由银杏内酯ABCJ和白果内酯组成的新产品，被开发并批准用于缺血性脑血管病的治疗。然而，其在阿尔茨海默病中的治疗效果尚不清楚。因此，首都医科大学附属北京安贞医院的刘广志教授团队开展了一项研究，在APP/PS1双基因转染HEK293细胞株(APP/PS1-HEK293)的AD细胞模型中，初步研究银杏内酯注射液及其成分(银杏内酯B和白果内酯)处理后对细胞活力的影响，初步评估该药物在细胞模型中的作用，并进一步探讨其相关作用机制。该研究结果已刊发在2022年6月的Appl Biochem Biotechnol（IF: 3.0）上。

方法

采用细胞计数试剂盒-8法筛选银杏内酯细胞增殖的最佳时间点和浓度。在此基础上，采用不同剂量银杏内酯对APP/PS1-HEK293进行体外共培养，酶联免疫吸附法检测细胞上清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平，western blotting和实时聚合酶链反应检测细胞内蛋白及NF-κB p65、i-κba、Bcl-2、Bax mRNA表达。

结果一

提高细胞活力：采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)法测定细胞活力。应用不同剂量银杏内酯(0 μg/ml、100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml、400 μg/ml)分别作用APP/PS1- HEK-293细胞0 h、24 h、48 h、72 h，倒置显微镜(100倍)观察细胞变化。银杏内酯处理APP/PS1-HEK293细胞48 h后，浓度为100µg/ml时细胞活力最高，将其选择作为细胞增殖的最佳浓度和时间点（图1、图2）。

图1 不同剂量银杏内酯对不同时间点细胞

图2 不同剂量银杏内酯对处理后48 h细胞

结果二

抗炎及抗凋亡：与对照组比较，高剂量组和低剂量组细胞内NF-κB p65和Bax蛋白和mRNA表达均降低，而i-κba蛋白和mRNA表达均升高（图3、图4）。

NF-κB p65（炎症信号通路活性介导）和i-κba（炎症信号通路活性抑制）在转录物水平和蛋白水平上的表达或积累分别较低和较高，表明银杏内酯可以通过抑制细胞内NF-κB信号的激活来提高细胞活力。

Aβ诱导的神经元凋亡导致神经元丢失在AD的发生发展中起着至关重要的作用，银杏内酯在转录物和蛋白水平上下调凋亡蛋白Bax的表达，上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并改变其在细胞核中的积累，这再次验证了银杏内酯在AD细胞模型中的抗凋亡作用。银杏内酯B和白果内酯在抗凋亡作用上的方向一致，提示它们可能通过多种机制协同发挥抗AD的凋亡作用。

图3 不同剂量银杏内酯及其组分(银杏内酯B和白果内酯)对NF-κB p65、i -κ ba、Bcl-2和Bax mRNA表达水平的影响

图4 Western blot检测细胞内NF-κB p65、i -κ ba、Bcl-2、Bax蛋白的表达。

(a)免疫印迹法。1对照组;2 低剂量银杏内酯;3 大剂量银杏内酯;4 银杏内酯B;5 白果内酯;(b)不同剂量银杏内酯及其组分(银杏内酯b和白果内酯)对细胞内NF-κB p65、i -κ ba、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。

结果三

降低炎性因子：大剂量银杏内酯处理组大鼠上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于对照组（图5）。在AD进程中，一旦小胶质细胞被a β激活，就会产生促炎细胞因子，如IL-6、IL-1β和TNF-α，又进一步加速AD的发展。本研究表明，银杏内酯对炎症的调节作用可能存在剂量依赖模式，而银杏内酯B和白果内酯对上述炎性细胞因子存在协同抗炎作用。

图5 不同剂量银杏内酯及其组分(银杏内酯B、白果内酯)上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的检测

结论

综上所述，本研究发现，银杏内酯显著提高APP/ PS1-HEK293细胞的活力，强烈表明其对AD的神经保护作用，至少部分是通过抑制NF-κB信号通路参与抗凋亡和抗炎症机制实现。然而，这个问题需要通过动物模型的体内研究，更重要的是，通过人体临床试验来进一步解决。在既往银杏内酯用于AD治疗的研究基础上，本项研究的发现进一步为阿尔茨海默病提供了新的治疗选择，银杏内酯注射液可能是一种有希望的治疗这种疾病的药物。

参考文献

1 Niu TT, Yin H, Xu BL, Yang TT, Li HQ, Sun Y, Liu GZ. Protective Effects of Ginkgolide on a Cellular Model of Alzheimer's Disease via Suppression of the NF-κB Signaling Pathway. Appl Biochem Biotechnol. 2022 Jun;194(6):2448-2464.

2 贾建平，陈生弟.神经病学[Ｍ].8版.北京:人民卫生出版社,2018:265-266.

3 殷贺,许保磊,牛天童等.银杏内酯对阿尔茨海默病细胞模型细胞活性的影响及其作用机制研究[J].中国医药,2020,15(08):1253-1257.

4 滕海英,许春艳,黄明等.银杏内酯注射液对阿尔茨海默病患者血清Aβ、BDNF水平和认知功能的影响[J].脑与神经疾病杂志,2020,28(05):280-28

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