Sci Immunol. | 白凡团队与合作者发现肿瘤浸润CD8+ T细胞代谢适应和效应功能维持的新机制

肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中T细胞效应功能的丧失是肿瘤进展和免疫治疗失败的主要原因之一【1-2】。近期研究发现，CD8+TILs中存在线粒体-内质网耦连增强的现象【3】，这一结果提示细胞器互作和代谢适应在重编程T细胞功能和命运中的重要性【4】。然而，目前这种细胞器相互作用是如何调控肿瘤浸润性CD8+ T细胞功能的生物学机制尚不清楚。

2023年9月22日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、生命科学学院白凡教授团队与合作者联合在Science Immunology上在线发表了题为Mitochondria-ER contact mediated by MFN2-SERCA2 interaction supports CD8 T cellmetabolic fitness and function in tumors的研究论文，揭示了MFN2介导的线粒体-内质网耦连通过维持线粒体钙稳态增强CD8+ T细胞在肿瘤微环境中的代谢适应和效应功能。通过上调CD8+T细胞中MFN2表达，增强线粒体-内质网耦连可有效改善肿瘤免疫治疗疗效，为MFN2介导的细胞器互作在T细胞抗肿瘤免疫中的作用提供了新的见解。

研究者首先利用SYSUCC肾透明细胞癌（ccRCC）队列，发现CD8+TILs中MFN2高表达的患者预后更好，该结论在其它癌种中也得到证实。通过分选ccRCC中CD8+TILs进行单细胞测序和实验验证，发现MFN2在CD8+T细胞激活后表达上调，并与更强的效应功能和线粒体氧化磷酸化能力相关，这一现象在非小细胞肺癌和结直肠癌中也得到证实，进一步发现AP-1 通路参与介导CD8+T细胞激活后MFN2表达的上调。为了深入验证MFN2对T细胞抗肿瘤功能的影响，研究者构建了T细胞中特异性敲除MFN2的条件性敲除小鼠（Mfn2flox/floxCD4Cre, CKO小鼠），利用皮下成瘤模型进行功能实验并分选CD8+TILs进行单细胞测序，分析MFN2对CD8+T细胞抗肿瘤免疫功能的影响。结果发现，MFN2敲除后，T细胞在肿瘤微环境中的效应功能、增殖和存活明显受损，对anti-PD-1治疗无应答，证明MFN2在维持体内CD8+T细胞抗肿瘤功能中的重要作用（图1）。

图1：临床特征与单细胞测序揭示MFN2与患者预后和CD8+ TILs功能关联

接着研究者通过转录组测序发现，MFN2敲除后线粒体氧化磷酸化和脂肪酸氧化代谢通路显著受到抑制。进一步代谢实验证明，MFN2敲除后主要损害线粒体利用脂肪酸作为底物氧化产生能量的能力。MFN2敲除后CD8+T细胞长期下调的线粒体代谢功能导致其抗肿瘤功能受到损害（图2）。

图2：MFN2敲除影响线粒体代谢功能损害CD8+T细胞抗肿瘤功能

紧接着研究者研究了MFN2敲除（Mfn2-/-）TILs线粒体代谢功能受损的机制。既往研究发现MFN2通过介导线粒体融合或线粒体-内质网耦连来调节线粒体代谢。利用三维超高分辨率共聚焦显微镜（3D-SIM）和透射电镜，研究者发现在Mfn2-/- CD8+TILs中，线粒体融合未受明显影响，而线粒体-内质网耦连显著下降。已知线粒体-内质网耦连能够促进Ca2+离子向线粒体转运，激活线粒体有氧代谢功能。作者发现Mfn2-/- CD8+TILs中线粒体 Ca2+水平明显降低；利用Ru360降低线粒体Ca2+水平可显著抑制CD8+TILs的线粒体代谢和效应功能。这些结果初步表明，MFN2介导的线粒体-内质网耦连以及由此导致的线粒体Ca2+内流对于CD8+ TILs的线粒体代谢和效应功能起着重要作用。研究者进一步探究了MFN2经典的促线粒体融合功能在CD8+ TILs中不占主导作用的原因。T细胞被肿瘤抗原激活后发生克隆增殖，而分裂的线粒体是T细胞增殖所需。作者发现T细胞活化后DRP1介导的线粒体分裂机器也随之激活，抵消了MFN2的线粒体融合效果，从而使T细胞依赖MFN2介导的线粒体-内质网耦连来维持线粒体良好的有氧代谢功能（图3）。

图3：MFN2介导线粒体-内质网耦连调节线粒体代谢

MFN2介导线粒体-内质网耦连的机制仍不清楚。既往研究指出，MFN2可能存在内质网定位，内质网上的MFN2负责介导该过程。为了探究其背后的分子机制，作者首先进行细胞组分分析实验，发现T细胞内质网上并无MFN2。为了深入研究其背后分子机制，作者在昆虫细胞中过表达全长MFN2蛋白并与T细胞裂解物孵育，利用Pulldown实验联用LC-MS/MS蛋白组技术鉴定了MFN2在内质网上潜在的互作蛋白—SERCA2；随后应用免疫共沉淀、邻近连接（PLA）试验、活细胞3D成像、体外蛋白Pulldown实验等技术手段，证实了MFN2和SERCA2的相互作用。研究者发现MFN2-SERCA2互作受MFN2 GTP酶活性和构象变化的影响：MFN2点突变R94Q失去与SERCA2互作能力，而点突变R259A却仍保留了该作用（图4）。

图4：MFN2通过与SERCA2互作介导线粒体-内质网耦连

作者进一步深入研究MFN2-SEACA2互作的生物学意义。通过体内外酶活实验和脂质体GUV实验，研究者发现，MFN2与SERCA2的互作可刺激SERCA2的Ca2+-ATP酶活性，从而将线粒体-内质网连接处的Ca2+回收到内质网，避免线粒体内Ca2+过载，维持细胞线粒体钙稳态，避免T细胞凋亡。应用线粒体-内质网连接肽（mito-ER linker）模拟SERCA2-MFN2在线粒体-内质网耦连中的物理连接作用，作者发现相比野生型T细胞，Mfn2-/- T细胞予mito-ER linker回补线粒体-内质网耦连后线粒体Ca2+显著过载，细胞凋亡增加，抗肿瘤功能下降。最后，利用OT-I背景的Mfn2-/- T细胞进行慢病毒过表达回补和尾静脉回输，并结合MFN2具有不同SERCA2蛋白互作能力的点突变（特别是R94Q和R259A），作者深入论证了MFN2-SERCA2互作介导的线粒体-内质网耦连和线粒体Ca2+内流对T细胞抗肿瘤功能的重要意义（图5）。

图5：MFN2-SERCA2互作介导线粒体-内质网耦连和线粒体Ca2+内流影响T细胞抗肿瘤功能

鉴于MFN2对肿瘤微环境中CD8+T细胞的重要作用，作者探索靶向T细胞中MFN2的治疗价值。利用原代肿瘤细胞制备的条件培养基（CM）模拟肿瘤微环境的营养条件，研究者发现CM可损害CD8+T细胞的MFN2表达、线粒体-内质网耦连、生存、线粒体代谢和效应功能；过表达MFN2则可增强CD8+T细胞对CM的适应能力。利用抗原特异性CD8+T细胞回输重建免疫的肾透明细胞癌PDX（Patient-derived xenografts）小鼠、OT-I小鼠和C57BL/6小鼠模型，研究者发现靶向T细胞中MFN2可显著增强T细胞的抗肿瘤功能，改善anti-PD-1治疗的疗效。

综上所述，本文通过临床标本验证、单细胞测序、转基因小鼠模型、细胞生物学和生化实验等多种技术手段，深入论证了MFN2-SERCA2互作介导的线粒体-内质网细胞器互作对CD8+T细胞在肿瘤微环境中代谢适应和发挥抗肿瘤功能的重要作用，初步揭示了线粒体-内质网耦连潜在的分子机制。这些发现共同揭示了MFN2在调控CD8+ T细胞的代谢、功能和存活方面的关键作用，并表明增强MFN2的表达是改善免疫疗法的一种有意义的途径。这些研究成果可能有助于我们更好地理解肿瘤免疫学，并为癌症患者的治疗提供新的策略。

打赏