科研丨东南大学: 不同加工程度的植物肉对小鼠血液生化水平、炎症及肠道微生物的影响(国人佳作)

编译：微科盟椰子，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

近年来，随着人们健康需求的不断提高，植物肉制品逐渐进入大众视野。然而，如今市场上的许多植物肉都经过了大量加工，使用了大量添加剂，因此它们可以被归类为超加工食品(UPFs)。非常有限的研究报告了当添加大量添加剂时，这些植物肉的益处是否会大打折扣。在本研究中，小鼠饲喂加工植物肉、超加工植物肉、低加工红肉和超加工红肉，比较它们对健康的影响。本实验检测了小鼠血清生化指标、肝脏和肠道苏木精-伊红(HE)染色、小鼠粪便16S rDNA测序和短链脂肪酸。与阴性对照组相比，超加工植物肉组、超加工红肉组和低加工红肉组小鼠体重明显增加，且存在肠道炎症和肝脏炎症。在肠道菌群方面，两个植物肉组的肠道菌群多样性和结构均优于两个红肉组。由此可见，植物肉和红肉会导致不同的肠道菌群结果，进而影响体重、肝脏和肠道炎症的发生。此外，植物肉比红肉更健康，但过度加工会降低植物肉的益处。因此，有必要改进植物肉的加工方式并减少添加剂的使用。    

论文ID

原名：Effects of different processing degrees of plant-based meat on the blood biochemical level, inflammation and intestinal microorganisms in mice

译名：不同加工程度的植物肉对小鼠血液生化水平、炎症及肠道微生物的影响

期刊：Food Research International

IF：8.1

发表时间：2023.8

通讯作者：王进

通讯作者单位：东南大学公共卫生学院

DOI号：10.1016/j.foodres.2023.113398

实验设计

结果

1 不同饮食对小鼠生长指数及部分器官长度或重量的影响

在42天的实验中，所有C57BL/6J小鼠自由饮食，生长良好，毛发光滑有光泽，未见异常或死亡。重复测量小鼠的日采食量。结果显示，各组小鼠的日采食量随时间的推移呈现出统计学差异(P < 0.001)，而时间*组无统计学差异(P > 0.05)，说明5组小鼠的日采食量无统计学显著差异。因此，两组之间的差异主要是由于添加了干预肉。图1(a)显示每只小鼠的日采食量。

实验前后，小鼠体重明显增加。但不同饮食组的增重幅度不同，如图1(b，c)所示。与NC组相比，超加工植物肉组(PBM2)、超加工红肉(UPM)和低加工红肉组(RM)小鼠体重显著增加，而加工植物肉组(PBM1)无显著差异。部分脏器指标如图1(d-g)所示。不同饮食组小鼠的附睾脂肪重量和盲肠重量均有差异，但NC组和PMB1的结果相似。两组的附睾脂肪重量低于其他三组，但盲肠重量高于其他三组。PBM2在上述两项指标上均接近UPM组和RM组。在结肠长度方面，两组之间没有统计学显著差异。只有NC组和PBM2组的肝脏重量有显著差异，其他组之间无统计学显著差异。

图1.小鼠体重及脏器的物理指标：(a)小鼠的基线体重和最终体重，(b)每三天体重的变化情况，(c)附睾脂肪重量，(d)盲肠重量；(e)结肠长度；(f)肝脏重量。

2 不同饮食对小鼠血液生化指标的影响

小鼠血液生化指标可以反映小鼠的基本生理和代谢状况。分析表明，PBM1组血糖水平高于PBM2组、UPM组和RM组。同时，其他组之间没有显著差异，并且RM组的血糖最低(图2a)。血脂四项指标如图2(b-e)所示，除TC外，UPM组其余三项指标均显著高于NC组。与NC组相比，PBM2组和UPM组血清ALT显著升高，PBM2组和RM组血清AST显著升高，而PBM1组与NC组无显著差异(图2f，2g)。最后，不同饮食组的血清TP和ALB浓度没有显著差异(图2h，2i)，但PBM2和UPM组的TBA往往低于其他三组(图2j)。根据上述结果，超加工植物肉组(PBM2)的结果与NC组和加工植物肉组(PBM1)的结果不同。

图2.各饮食组小鼠的血液生化指标：(a)空腹血糖(FBG)，(b)总胆固醇(TC)，(c)甘油三酯(TG)，(d)高密度脂蛋白(HDLC)，(e)低密度脂蛋白(LDL-C)，(f)丙氨酸氨基转移酶(ALT)，(g)天冬氨酸氨基转移酶(AST)，(h)总蛋白(TP)，(i)白蛋白(ALB)，(j)总胆汁酸(TBA)。

3 不同饮食组小鼠结肠和肝脏组织HE染色

每组各有一半(5只)小鼠的肝脏和结肠组织进行HE染色。结果显示，NC组和PBM1组有5只小鼠未见明显的组织损伤。PBM2组中只有1-2只小鼠有轻微的组织损伤。UPM组和RM组均有一半以上的小鼠存在明显的组织损伤。 图3(a-e)显示了每组小鼠的肝脏HE染色图，分别对应于NC组、PBM1组、PBM2组、UPM组和RM组。NC组和PBM1组肝索排列整齐，未见明显损伤或坏死，如图3(a，b)所示。RM组可见碎片状坏死和炎性细胞浸润，如图3(e1，e2)中红色箭头所示。UPM组也可见明显的炎性细胞浸润，如图3(d)中红色箭头所示。与RM组和UPM组相比，PBM2组肝细胞损伤明显减轻，仅有少量炎性细胞浸润，如图3(c)中红色箭头所示。 图3(f-j)为各组小鼠的结肠HE染色，分别对应于NC、PBM1、PBM2、UPM和RM组。NC组和PBM1组(图3f，g)视野内可见粘膜层、粘膜肌层、粘膜下层和肌层等组织。粘膜上皮细胞完整，无坏死和脱落。粘膜层可见大量杯状细胞，肠腺丰富，排列整齐。粘膜下间隙大小均匀，未见扩张。肌层厚度无明显变化。组织形态结构正常，无明显病理改变。PBM2组(图3h)纤维组织被取代，局部组织形态结构不完整，可见弥漫性炎性细胞浸润，如红色箭头所示。UPM组(图3i)视野内可见粘膜下结缔组织增生伴炎性细胞浸润。RM组(图3j)的情况与PBM2组相似，但炎性细胞浸润面积更大。

综上所述，NC组和PBM1组小鼠肝脏和肠道组织未见明显病变，PBM2组肝脏和肠道组织有轻度炎症，UPM组和RM组小鼠肝脏和肠道组织有明显病变。

图3.各饮食组小鼠肝脏HE染色：(a) NC，(b) PBM1，(c) PBM2，(d) UPM，(e1，e2) RM；各组小鼠结肠HE染色：(f) NC，(g) PBM1，(h) PBM2，(i) UPM，(j) RM。

4 不同饮食组小鼠粪便16S测序及SCFAs结果 4.1 不同饮食组小鼠肠道菌群的α和β多样性

微生物群多样性(Shannon和Simpson指数)和微生物群丰富度(ACE和Chao1)的测量值如图4(a-d)所示。PBM1组和PBM2组的Shannon指数显著高于其他三组(P < 0.05)，这两组Simpson指数均显著高于UPM组和NC组(P < 0.055)。在ACE指数和Chao1方面，NC组均低于PBM1、PBM2和RM组(P < 0.05)。

β多样性是指样本之间的多样性。在肠道菌群分析中，β多样性是衡量个体间微生物组成相似性的指标。主坐标分析(PCoA)和非度量多维标度(NMDS)分析的结果分别如图4(e，f)所示。在OTU水平上选择二进制Jaccard进行两种分析。该分析表明，PBM1组和PBM2组小鼠具有相似的肠道菌群组成。综上所述，植物性饮食模式增加了肠道微生物群的多样性和丰富度。

图4.不同饮食组小鼠肠道菌群的α多样性(a-d)和β多样性(e-f)：(a) Shannon指数、(b) Simpson指数、(c) ACE指数、(d) Chao1指数、(e) NMDS分析、(f) PCoA分析。

4.2 不同饮食组小鼠肠道菌群组成的差异

图5(a)显示了不同饮食组小鼠的门水平肠道微生物组成。在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门是两个优势门。图5(c，d)显示了不同饮食组小鼠肠道厚壁菌门和拟杆菌门菌群。与NC组相比，其他四组的厚壁菌门相对丰度均有所增加，且PBM1组和RM组显著高于NC组(P < 0.05)。UPM组和RM组小鼠肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度低于其他三组。厚壁菌门与拟杆菌门的比率(F/B)越高，人体就越容易吸收能量，导致肥胖，这一事实已得到证实。UPM组和RM组的F/B显著高于其他三组(P< 0.05)（F/B：NC组0.95，PBM1组1.04，PBM2组1.10，UPM组1.33，RM组1.61）。除上述两个菌门外， 疣微菌门 为次优势菌门。PBM1组疣微菌门的相对丰度显著低于其他四组(P< 0.05)，PBM2组次之(NC组26.33%，PBM1组2.98%，PBM2组14.33%，UPM组26.65%，RM组20.89%)。 不同饮食组小鼠的属水平肠道微生物组成如图5(b)所示。PBM1组小鼠嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)的相对丰度低于其他四组，该菌在各组所占比例分别为NC组26.3%、PBM1组3.0%、PBM2组14.3%、UPM组26.6%、RM组20.9%。

为了进一步分析不同饮食组肠道菌群的变化，采用LEFSe方法从门到种水平分析肠道微生物群。结果显示，当LDA阈值为4.0时，五组之间有29个分类群存在显著差异(图6 a，6b)。其中UPM组11个，RM组2个，PBM2组8个，PBM1组8个。NC组无显著差异分类群。

图5.不同饮食组小鼠粪便16S测序和SCFAs结果。饲喂不同饮食的小鼠门(a)和属(b)水平微生物组成以及微生物群的比较：(c)厚壁菌门，(d)拟杆菌门。各组SCFAs水平：(e)总酸、(f)乙酸、(g)丙酸，(h)丁酸。

图6.采用LEFSe分析微生物群落组成特征。(a)不同组间肠道菌群的差异细菌满足显著LDA阈值>4.0。(b)基于LEfSe的进化分支图显示了不同组之间肠道菌群的差异细菌。

4.3 不同饮食组小鼠SCFAs测定结果

短链脂肪酸(SCFAs)是肠道微生物群的重要代谢产物之一。不同饮食组小鼠的SCFAs水平不同，结果如图5e-g所示。在总酸水平上，除UPM组低于NC组外，其余三组均高于NC组，但差异无统计学意义(图5e)。在其他SCFAs水平上，PBM1组和RM组的乙酸、丙酸和丁酸水平均高于NC组。PBM1组丁酸水平高于其他组(图5 f-g)。这些结果表明，不同的肉类可以影响肠道微生物代谢，植物肉可以提高主要SCFAs的水平。

讨论

红肉的种类繁多，烹饪方法也多种多样，几乎每天都会出现在餐桌上。红肉富含人体生长发育所需的脂肪、优质蛋白质、矿物质和多种维生素等营养物质。特别是含有8种人体不能合成的必需氨基酸。因此，与植物蛋白相比，动物蛋白具有更高的生物效价。虽然肉类营养丰富，但也要注意其健康风险。吃太多的红肉，如猪肉和牛肉，可能会导致脂肪摄入过多，容易导致肥胖。过多的动物蛋白还会增加胃肠道的负担，容易引起消化不良，甚至会增加肠癌的患病率。世界癌症研究基金会/美国癌症研究所报告称，红肉和加工肉的摄入量可能与结肠癌风险相关。此外，过量摄入加工红肉还会导致炎症性肠病和功能性胃肠道疾病。本研究通过与不同加工程度的红肉进行比较，研究了不同加工程度的植物肉对小鼠血脂水平、炎症水平和肠道微生物的影响。 本研究发现，与NC组相比，RM组小鼠的体重显著增加，因为过量摄入肉类更容易导致肥胖。与NC组相比，超加工红肉饮食组的小鼠体重也显著增加，主要是因为超加工食品的能量密度更高，总脂肪、饱和脂肪、反式脂肪和糖含量更高，而纤维、蛋白质和钾含量较低，营养价值较低。由于控制人体饱腹感的机制对体积比能量含量更敏感，能量密度较高的食物可能会促进能量的过度摄入。此外，超加工食品(UPF)的设计是对消费友好型的，给消费者一种不那么饱腹的感觉，这样消费就会更频繁、更大程度地发生，从而增加能量摄入。但与其他三组相比，NC组和PBM1组小鼠的血糖水平呈上升趋势，且PBM1组与其他三组之间的差异显著。可能的原因是，研究只持续了7周，不同饮食对小鼠的影响还不够彻底。肥胖小鼠仍处于肥胖的早期阶段。据报道，肥胖早期可能导致胰岛素分泌过多，胰岛素分泌异常可能导致禁食后血糖水平下降。 PBM2组小鼠的体重也明显高于PBM1组，这可能是因为PBM2饮食中使用的植物肉替代品含有许多添加剂，加工后糖、脂肪和能量都很高，被认为是超加工的。PBM2组、UPM组和RM组的附睾脂肪重量和肝脏重量均高于NC组，这与体重变化相一致。长期食用UPF和红肉会导致血脂异常，特别是饮食中过多的脂肪和胆固醇会极大地增加患血脂异常的风险。血脂异常的特征是血液中甘油三酯和胆固醇水平较高，这与各种系统性疾病有关。与NC组和PBM1组相比，PBM2组、UPM组和RM组血清TC水平显著升高。此外，PBM2组和UPM组小鼠的血清LDL-C水平显著高于NC组和PBM1组，推测PBM2组和UPM组小鼠存在较明显的血脂异常。 本研究还发现，与NC组相比，PBM2和UPM组小鼠血清AST显著升高，PBM2组AST和ALT均升高，由此推断PBM2和UPM组存在肝损伤。可能的解释是，PBM2组和UPM组都是超加工饮食组。对健康成年人的横断面和队列研究表明，超加工食品与较高的ALT和AST水平有关。这可能有几个原因，首先是超加工食品的营养特性。由于其复杂的工业加工，例如，添加大量饱和脂肪酸和反式脂肪酸可能会增加超加工食品的稳定性和适口性，这些营养物质与人类和啮齿动物肝脏脂肪的增加有关。超加工食品和肝脏健康之间关联的另一种机制可能与这些产品加工过程中使用的添加剂有关。虽然非营养添加剂的健康特性在人体中的研究相对较少，但目前对啮齿动物和细胞系的研究表明，它们可能对肝脏有害，这种影响可能是通过肠道菌群的失衡来调节的。一些人工甜味剂(例如糖精、阿斯巴甜)、乳化剂(例如聚山梨酸酯80)、防腐剂(例如苯甲酸)和风味增强剂(例如谷氨酸钠)可能会导致啮齿动物肝脏脂肪变性、退化和毒性。 饮食结构是决定肠道菌群结构的重要因素。UPM组和RM组的饮食模式中含有大量的红肉，导致两组小鼠肠道菌群结构发生变化。这种变化表现为肠道微生物群多样性和拟杆菌减少，以及较大的F/B，并与体重增加和肠道炎症有关。研究表明，较大的F/B可以使身体完全吸收食物中的卡路里，很容易将卡路里转化为脂肪并积聚在皮肤中，从而增加体重并导致肥胖。PBM1组和PBM2组嗜黏蛋白阿克曼氏菌的相对丰度低于其他三组。可能的原因如下：拟杆菌具有很高的降解日粮中纤维素的能力。因此，充足的纤维素膳食摄入可能会增加拟杆菌的相对丰度。两个植物肉组中拟杆菌的相对丰度较高，因此嗜黏蛋白阿克曼氏菌的相对丰度有所下降。食用高脂肪、高糖和高纤维的饮食可能会减少对拟杆菌的需求，从而降低它们的相对丰度。此外，拟杆菌的低丰度与肠道炎症有关。这解释了为什么在RM组和UPM组中拟杆菌的相对丰度降低，并出现肠道炎症。肠道微生物的多样性和稳定性是影响健康的重要因素，而多样性的丧失是肠道微生态失调的典型特征。与PBM1组相比，PBM2组肠道菌群多样性较低，F/B值较大，这可能与PBM2组超加工植物性饮食中添加的添加剂较多有关。研究表明，添加剂可导致肠道屏障障碍，促进肠道菌群的变化。 本文主要研究了乙酸、丙酸、丁酸三种短链脂肪酸(SCFAs)以及总酸的含量。不同饮食组间SCFAs的表达水平不同。与NC组相比，PBM1组和RM组的SCFAs表达水平呈上升趋势。尤其在丁酸水平上，PBM1组的升高趋势更为明显。不幸的是，这些差异大多数并不显著。小鼠体内短链脂肪酸变化的确切时间取决于研究设计、饮食干预和测量方法，可能需要几天到几周的时间。进行为期6周的饮食干预，为了保证动物的健康和适当的营养摄入，在实验饮食中只添加20%的干预剂。干预时间短、干预量小可能导致不同饮食组间短链脂肪酸的差异不显著。SCFAs是肠上皮细胞的重要能量来源，尤其是丁酸、丙酸和乙酸。研究表明，SCFAs有助于维持肠上皮细胞的完整性，增强屏障功能，并减少肠道炎症。这与PBM1组小鼠肠道菌群多样性增加，肠道无明显炎症反应相一致。

结论

过度加工可能会使原本优质健康的植物肉变成超加工食品，长期食用会对小鼠产生不良影响。相反，低加工不会掩盖植物肉的好处，并且可以保持其健康益处。可以避免小鼠肥胖、血脂异常、肝脏和肠道炎症的发生，并能改变肠道菌群结构，导致肠道菌群多样性较高。它还可以增加短链脂肪酸的产生。因此，如何控制植物肉制品的加工程度还需要进一步的实验研究。

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