蛋白表达最常见的12个问题解析（上）

我不知道我的蛋白它有什么特性及其结构？

1. 首先要确定一件事，那就是这几个蛋白质有人研究过没有？还是最新发现的蛋白质？如果没有人研究过，那就得 用先测部分氨基酸，然后设计引物克隆了。

2. 如果有人研究过，可以根据软件来预测。如有swiss—pdb软件，但这个是要有氨基酸序列，知道基因序列，可以在ncbi上进行blastx，得到蛋白。

如何选择蛋白表达宿主菌？

原核系统和真核细胞偏爱的密码子有不同，因此，在用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。

一般选择菌主可看下表：

质粒测序正确，蛋白无法表达

1. 分析一下稀有密码子，如果比较多，可以尝试rosetta（DE3）

2. 可能是基因本身的问题。RNA3’的特殊结构可能导致转录出现问题，这种情况可以尝试融合表达，譬如pET-32a。

3. 也许是表达量太低，也可以试一下western blot，定性的检测一下。

如果IPTG诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？

T7 RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性 能。也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合 （比如含有pLysE的宿主菌）等，这时在 诱导后菌落还是会继续生长。

如何提高重组蛋白在原核细胞里的表达水平，特别是可溶性表达？

这个问题是最困扰做原核蛋白表达纯化的人的。比如大肠杆菌表达蛋白本身表达量就大，但是表达的大都是包涵体，想要获得可溶性蛋白，就需要做复性，或是再设计实验时就想办法让其在上清中表达。一般就要通过基因优化，载体宿主优化筛选，表达条件优化，诱导条件优化等等。

1. 降低重组蛋白合成的速率

可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。高水平表达时，肽链聚集的速率一旦 超过折叠速率，就会形成包涵体。因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。

2. 密码子优化

密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳 定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。。

3. 表达温度的选择

大肠杆菌的最适生长温度在37～39℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白，降低可溶性蛋白的表达，而低温培养条 件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。

4. 诱导条件优化

摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。 然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。

目的蛋白总是以不可溶的形式出现

在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50% 以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实践中，有很多实验室采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得 更多的可溶蛋白。然而，让目的蛋白以包涵体形式聚集也并非总是坏事。不溶态在某些情况下非常有利：

1. 形成包涵体是目的蛋白表达量很高的表现。

2. 作为初步分离，将目的蛋白的包涵体纯化出来非常简便。用核酸酶处理，并经简单洗涤，通常可以获得纯度达75– 95%的目的蛋白。

3. 存在于包涵体中的目的蛋白通常可以免于蛋白酶的水解破坏作用。 研究者采用下述方法加强蛋白重折叠的效果，并在很多蛋白上取得了好结果，可以尝试以下：当蛋白还结合在树脂上时，使 用6M-8M梯度盐酸胍、1mM还原型及0.2mM氧化型谷胱甘肽处理，继而用咪唑正常洗脱。有些实验室在透析去除变性剂的 过程中加入底物或类似物，也有帮助酶折叠的效果。