氧连接的N‑乙酰葡糖胺修饰在缺血性疾病损伤中的作用研究进展

崔佳慧邱珍 夏中元

武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060

国际麻醉学与复苏杂志,2023,44(08):885-890.

DOI：10.3760/cma.j.cn321761-20230423‑00869

基金项目 

国家自然科学基金（82202408，82172160）；武汉大学自主科研项目（2042021kf0113）

REVIEW ARTICLES

【综述】

随着人们健康意识的不断增强，急性心肌梗死（myocardial infarction, MI）、脑卒中等一系列起病急、病程凶险且预后差的缺血性疾病成为当前医疗领域的重点关注对象。近年对缺血性疾病损伤相关分子生物学机制的研究逐渐深入，氧连接的N‑乙酰葡糖胺（O‑linked β‑N‑acetylglucosamine, O‑GlcNAc）修饰作为广泛存在于细胞核与细胞质中的特殊蛋白质修饰方式受到学者们的关注。近期研究发现，提高细胞内O‑GlcNAc修饰水平能够增强细胞对应激的耐受性，并在缺血性疾病损伤中起到抵抗氧化应激损伤、促进细胞自噬、维持线粒体能量代谢平衡以及减少细胞凋亡等作用。本文综述了目前在缺血性损伤疾病中，O‑GlcNAc修饰对蛋白质的修饰机制及O‑GlcNAc在缺血性损伤疾病中发挥的作用，旨在为O‑GlcNAc修饰相关基础研究提供思路，并为缺血性损伤疾病的临床治疗提供新的预防措施和治疗思路。

1、缺血性疾病的损伤机制     

缺血性疾病损伤本质是由于机体血管阻塞或血流灌注不足导致组织或细胞供血供氧不足，通过引发细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）大量聚集、线粒体功能紊乱、钙离子超载、细胞自噬以及细胞凋亡等一系列病理生理现象，进而导致组织细胞稳态失衡，最终造成组织结构不可逆损伤。

2、O‑GlcNAc修饰

O‑GlcNAc修饰是将单个N‑乙酰葡萄糖胺（N‑ Acetyl‑D‑glucosamine, GlcNAc）通过O‑糖苷键与目的蛋白的丝氨酸（serine, Ser）/苏氨酸（threonine, Thr）羟基相连的蛋白质修饰过程。这种蛋白质修饰与机体的血糖水平密切相关，正常情况下细胞通过己糖胺生物合成途径（hexosamine‑biosynthesis pathway, HBP）将摄取的葡萄糖转换为O‑GlcNAc修饰的糖供体［尿苷‑二磷酸N‑乙酰氨基葡萄糖（uridine‑ diphosphate N‑acetylglucosamine, UDP‑GlcNAc）］，当机体处于低血糖水平时，细胞内蛋白质的糖基化水平下降。O‑GlcNAc修饰还受到O‑GlcNAc糖基转移酶（O‑GlcNAc transferase, OGT）和O‑GlcNAc糖苷水解酶（O‑GlcNAcase, OGA）的直接调控，OGT能够将GlcNAc添加到目标蛋白质上，提高细胞内蛋白质的O‑GlcNAc糖基化水平；OGA则反之。这两种生物酶的存在使机体细胞在面对突发事件时能在较短时间内发生O‑GlcNAc修饰循环，通过糖基化修饰靶蛋白进而参与机体的信号转导、生长代谢、免疫应答等重要生命进程，起到调控应激的作用。

3、O‑GlcNAc修饰在缺血性疾病损伤中的机制

3.1、O‑GlcNAc修饰与线粒体功能

3.1.1、O‑GlcNAc修饰与线粒体动力学

动力相关蛋白质1（dynamin‑like protein 1, DRP1）作为调控线粒体分裂的关键蛋白质能直接影响线粒体网络形态。DRP1表达降低可抑制线粒体裂变，有助于线粒体灌注增加，因此在缺氧条件下，其介导的线粒体过度分裂是缺血性疾病损伤预后不良的主要原因。临床数据显示，MI患者的DRP1表达显著增加，抑制DRP1表达能恢复线粒体部分功能，并有效降低MI后心肌损伤程度。敲除OGA基因破坏O‑GlcNAc修饰循环后的MI小鼠心功能大幅度下降，表现出心衰体征；而过表达OGT的心肌细胞处于缺氧环境时，其磷酸化DRP1水平显著升高，线粒体功能出现障碍。DRP1发生O‑GlcNAc修饰能促进DRP1从细胞质转移至线粒体，诱导线粒体碎裂，而使用Mdivi抑制细胞内糖基化修饰水平能减少心肌细胞线粒体的分裂，改善MI后心功能，起到心肌保护作用。因此，在缺血性疾病损伤中通过维持稳定的O‑GlcNAc修饰循环或抑制DRP1的O‑GlcNAc以维持线粒体功能与形态，发挥细胞保护作用。

3.1.2、O‑GlcNAc修饰与线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, mPTP）

在缺血性疾病损伤中，mPTP通过增加线粒体内膜的通透性，改变线粒体的形态结构并诱导线粒体外膜破裂。研究发现，通过提高OGT表达，增强细胞O‑GlcNAc修饰能够抑制氧化应激后心肌细胞mPTP的开放，减弱线粒体钙超载现象，同时减轻了因缺氧导致胞质内H2O2含量增加而诱导的mPTP形成。但细胞中长期高水平的O‑GlcNA状态导致OGA表达增加，减弱细胞呼吸，通过抑制核转录因子红系2相关因子2进而抑制细胞的氧化应激反应，降低细胞内ROS的生成，增高线粒体膜电位。

3.1.3、O‑GlcNAc修饰与线粒体能量代谢

OGT作为营养感受器，其表达依赖于机体血糖水平调控，过表达OGT或处于高糖环境中促使细胞内ROS水平升高，减少线粒体ATP生成，影响线粒体能量代谢。相反，在中度缺氧及葡萄糖剥夺造成损伤的海马神经细胞中，通过促进神经细胞内蛋白质O‑GlcNAc修饰并增强神经细胞对葡萄糖的摄取，有利于神经细胞线粒体能量恢复，同时具有明显的神经保护作用。心肌细胞线粒体呼吸链蛋白质作为O‑GlcNAc修饰的主要靶标，提高其O‑GlcNAc修饰水平会损伤线粒体功能。过表达OGT或OGA，通过破坏O‑GlcNAc循环平衡，导致细胞呼吸功能受损并影响能量代谢。但短期急性升高的O‑GlcNAc修饰可以提高细胞的最大呼吸能并对抗伤害性刺激。

总之，线粒体作为细胞有氧呼吸的重要场所，在缺血性疾病损伤中，细胞内O‑GlcNAc修饰水平升高诱导其过度分裂，导致线粒体动力学紊乱，不利于线粒体维持正常的能量代谢并增高线粒体的膜电位。

3.2、O‑GlcNAc修饰与细胞凋亡

细胞凋亡是细胞应对环境变化或生理及病理性刺激，自发的生理性死亡程序。机体发生缺血性疾病时，不利于组织细胞存活的信号分子被大量激活，而O‑GlcNAc修饰能够竞争性抑制蛋白激酶B （protein kinase B, PKB）的磷酸化，启动细胞凋亡途径发挥保护作用。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3‑kinases， PI3K）‑PKB在缺血缺氧的心肌细胞中表达增加，并通过磷酸化激活PI3K和PKB，抑制细胞凋亡。研究发现，细胞处于缺血缺氧条件下，通过激活PI3K‑PKB通路抑制细胞凋亡发生，而提高葡萄糖胺的水平，可以激活PKB并提高下游蛋白质的O‑GlcNAc修饰水平，进而提高肾髓质细胞缺血损伤后的存活数量。研究证实，在缺血脑组织中PKB磷酸化水平与蛋白质的O‑GlcNAc修饰水平呈负相关，过表达OGT促进神经细胞O‑GlcNAc修饰增加，使PKB的Thr308和Ser473位点发生O‑GlcNAc修饰，从而下调PKB的磷酸化水平并抑制PKB的激活，继而促进神经细胞凋亡，不利于缺血脑组织的功能恢复。有学者认为，细胞内O‑GlcNAc修饰水平升高仅诱导PKB的Ser473位点发生磷酸化，通过增高神经细胞内O‑GlcNAc修饰水平抑制细胞凋亡，在缺血性疾病损伤中发挥保护作用。虽然学者们对于PKB的O‑GlcNAc修饰位点存在争议，但不可否认的是，在缺血性疾病损伤发生、发展过程中O‑GlcNAc修饰通过诱导受损细胞凋亡，有利于缺血性疾病的转归。

缺血性疾病损伤导致细胞内葡萄糖供应不足，引发的线粒体能量代谢障碍也是触发细胞凋亡的关键要素。心肌细胞处于高糖环境时，mPTP的钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的Ser第280位点发生O‑GlcNAc修饰，促进心肌细胞肌质网中钙离子泄露，使胞质内钙离子与ROS大量聚集，从而刺激mPTP开放，加重MI后心肌细胞损伤并诱导细胞凋亡。mPTP的重要组成结构［电压依赖性阴离子通道（voltage‑dependent anion channel, VDAC）］的形成依赖于O‑GlcNAc修饰。而敲除OGT基因或者抑制OGT基因下游蛋白质的表达，能降低心肌细胞内线粒体VDAC的O‑GlcNAc修饰水平，促进线粒体钙超载并诱导mPTP形成，使线粒体膜电位丧失，加剧缺氧后心肌细胞凋亡。

3.3、O‑GlcNAc修饰与氧化应激

内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）是细胞的一种特殊应激保护机制，用于清除内质网（endoplasmic reticulum, ER）中的未折叠蛋白质（unfolded protein response, UPR）。缺血性疾病损伤常伴随着UPR和大量ROS的产生，并诱导ERS的发生，而ERS可以通过ROS诱导细胞发生氧化应激刺激UPR反应，发挥细胞保护作用。

急性心肌缺血后，血管内皮因子通过产生ROS诱导ER内大量UPR的堆积，引发ERS并增加血管的代偿性生成。在缺血缺氧条件下，细胞能通过产生UPR激活受损的ER功能，从而对抗ERS引发的细胞急性应激，起到细胞保护作用。肌醇需求酶1和蛋白激酶R样内质网激酶作为ERS的激活因子，通过诱导人X盒结合蛋白质1（X‑box binding protein 1, XBP‑1）过表达，增加HBP通量并提高细胞内O‑GlcNA修饰水平。研究发现，神经系统中XBP‑1的表达与XBP‑1激活UPR的能力都与年龄呈负相关，而老龄大脑细胞内UDP‑GlcNAc的基础水平和O‑GlcNAc修饰介导的对抗应激损伤通路活性急剧下降更易引发缺血性损伤。在神经系统的缺血性疾病损伤中，通过补充神经系统内的XBP‑1，能够逆转并减轻ER损伤。研究发现，O‑GlcNAc修饰水平在XBP‑1的调控下发挥神经保护作用并改善脑功能，敲除XBP‑1的小鼠发生缺血性卒中后损伤更严重，这提示XBP‑1可能通过XBP‑1/HBP/O‑GlcNAc轴抑制神经细胞ERS。在短暂缺血性卒中模型中，老龄小鼠脑内UDP‑GlcNAc水平进一步下降，应用氨基葡萄糖后，通过XBP‑1/HBP/O‑GlcNAc轴促进UDP‑GlcNAc含量增加，促进老年动物发生缺血性卒中后的神经细胞功能恢复。还有研究发现，补充氨基葡萄糖还能通过XBP‑1/HBP/O‑GlcNAc轴促进小鼠脑内神经细胞内相关蛋白质发生O‑GlcNAc糖基化，有利于心搏骤停后神经细胞功能恢复和预后。因此，提高细胞内蛋白质的O‑GlcNAc修饰水平能够抑制ERS，对抗缺血性损伤疾病产生的UPR对内质网的损害。

沉默信息调节因子1（sirtuin 1, Sirt1）通过去乙酰化参与细胞氧化应激调节过程。研究发现，Sirt1的Ser第549位点发生O‑GlcNAc修饰并高度保守，增高Sirt1的O‑GlcNAc修饰水平，可以增加Sirt1脱乙酰酶的活性，能够起到增强细胞抗氧化应激的作用。而脑卒中引发的脑缺血性损伤是通过下调Sirt1的表达，使ROS的生成增加，导致神经细胞发生氧化应激并诱发过度炎症反应，不利于神经细胞存活。研究表明，在应激条件下提高线粒体相关蛋白的O‑GlcNAc修饰水平，可以起到维持线粒体能量和结构稳定以及减轻神经细胞线粒体氧化应激的作用，进而发挥神经细胞的保护功能。

3.4、O‑GlcNAc修饰与炎症

适度的抗炎治疗在缺血性疾病损伤早期阶段有利于细胞功能恢复。MI过程中炎症和纤维化机制相互交织，敲除OGT基因的小鼠在结扎冠状动脉诱导MI后，O‑GlcNAc修饰水平降低，心功能障碍加剧并伴随心室结构过度重构，预示着MI预后不良。研究表明，过表达OGT能增强NF‑κB p65与核因子活化的T细胞的O‑GlcNAc修饰水平，导致其磷酸化水平下降，进而减少炎症反应的发生，起到抑制心肌重塑的作用。因此，在发生急性缺血缺氧时，组织通过O‑GlcNAc循环短期内抑制NFAT和NF‑κB的活性，防止受损细胞过度募集炎症细胞和炎症因子，有利于缺血性疾病损伤的预后。

3.5、O‑GlcNAc修饰与细胞自噬

线粒体自噬在维持细胞和机体的稳态中发挥重要作用，能够将受损的细胞器和功能失调的细胞及组织选择性清除。在低糖状态下，心肌细胞通过增加OGT的含量进而抑制糖原生成，促进蛋白质发生O‑GlcNAc修饰是其发生自噬的关键。心肌细胞内蛋白的糖基化水平与心肌细胞自噬水平呈正相关。unc‑51样自噬激活激酶1（unc‑51‑like kinase 1, ULK1）属于Ser/Thr蛋白激酶，其作为诱导线粒体自噬的启动蛋白质，在葡萄糖缺乏时促使线粒体发生自噬。新生小鼠的心肌细胞发生自噬依赖于OGT基因的表达，在特异性敲除OGT基因的小鼠原代心肌细胞中，降低细胞内ULK1的O‑GlcNAc修饰水平后，ULK1激活水平下调，进而抑制心肌细胞发生自噬，导致心肌细胞应对缺血性疾病损伤的应激能力下降。

炎症因子在MI早期阶段的快速募集也是引发心肌细胞自噬的关键，而自噬的启动有利于发生缺血性疾病损伤的心肌组织的存活及功能的维持，并在MI后发挥心肌保护作用。细胞内突触体相关蛋白29（synaptosome associated protein 29, SNAP29）在细胞自噬过程中促进自噬体与溶酶体的融合，而SNAP29发生O‑GlcNAc修饰后形成的复合物能抑制心肌细胞中自噬小体的降解。因此，在缺血性疾病损伤中，O‑GlcNAc修饰通过维持自噬水平发挥保护作用。

4、问题与展望

O‑GlcNAc修饰能够调节细胞和机体生理功能，通过对抗氧化应激、抑制细胞凋亡、抑制ERS等途径在缺血性疾病损伤中发挥关键作用，但仍有一些问题需解决：① 蛋白质长期处于较高的O‑GlcNAc修饰水平可能不利于维持缺血性疾病损伤中的细胞稳态，其机制尚未明确；② O‑GlcNAc修饰的糖供体与糖代谢密切相关，长期持续的高血糖状态可能会影响缺血性损伤疾病中蛋白质的O‑GlcNAc修饰水平；③ 糖基化修饰主要发生于Ser/Thr糖基化，前期研究发现，线粒体蛋白质富含大量的Ser/Thr（糖基化修饰的主要靶标），但对缺血性疾病损伤的线粒体蛋白质具体修饰位点以及修饰后线粒体稳态及功能的调节尚待深入研究。

总之，O‑GlcNAc修饰在缺血性疾病损伤中扮演重要作用。同时，运用靶向O‑GlcNAc修饰预防缺血性疾病损伤仍需更多基础实验和临床研究支持。阐明O‑GlcNAc修饰在缺血性疾病损伤中的作用机制，在人类健康方面具有潜在的治疗价值。