科研丨中国农大: 银杏叶提取物通过重塑肠道菌群减轻蛋鸡脂肪肝出血综合征(国人佳作)

编译：微科盟薇薇，编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读

银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)被证明可 有效预防和缓解代谢性疾病，包括肥胖、糖尿病和脂肪肝疾病。然而，GBE在缓解蛋鸡脂肪肝出血综合征(FLHS)中的作用及其潜在机制仍有待阐明。本文研究了GBE对FLHS的缓解作用，重点研究了GBE对鸡肠道微生物群的调节作用。结果表明，GBE处理通过降低TG、TC、ALT和ALP水平，改善了高脂饲料(HFD)诱导的FLHS蛋鸡模型的血液生化指标。GBE处理后肝脏脂质积累和病理评分均有所减轻。此外，GBE处理通过上调GSH、SOD、T-AOC、GSH-PX，降低MDA含量以及下调肝脏脂质合成相关基因(FAS、LXRα、GPAT1、PPARγ和ChREBP1)和炎症因子(TNF-α、IL-6、TLR4和NF-κB)的表达，增强了肝脏和血清的抗氧化活性。微生物谱分析显示，GBE重塑了受HFD干扰的肠道微生物群，特别是提高了盲肠中Megasphaera的丰度。同时，对SCFAs的靶向代谢组学分析显示，GBE处理显著促进了总SCFAs、乙酸和丙酸的产生，这与GBE富集的肠道菌群呈正相关。最后，本研究证实了GBE改变的肠道微生物群足以通过粪便微生物群移植(FMT)缓解FLHS。本研究提供的证据表明，GBE通过重塑肠道微生物群的组成来缓解HFD诱导的蛋鸡FLHS。本研究揭示了GBE抗FLHS的作用机制，为今后在蛋鸡行业中应用GBE作为添加剂防治FLHS奠定了基础。    

论文ID

原名：Ginkgo biloba extract alleviates fatty liver hemorrhagic syndrome in laying hens via reshaping gut microbiota

译名：银杏叶提取物通过重塑肠道菌群减轻蛋鸡脂肪肝出血综合征

期刊：Journal of Animal Science and Biotechnology

IF：7.0

发表时间：2023.8

通讯作者：胡永飞

通讯作者单位：中国农业大学动物科学技术学院

DOI号：10.1186/s40104-023-00900-w

实验设计

结果

1补充GBE可改善HFD诱导的蛋鸡FLHS

为了评估GBE对FLHS的治疗效果，作者用0.12% GBE对HFD诱导的蛋鸡进行了为期16周的治疗。与ND组相比，HFD组蛋鸡的体重、心脏重量、肝脏重量、腹部脂肪重量和腹部脂肪比显著升高，但GBE处理有效降低了这些指标(图1A-C)。肝组织H&E染色及表型图显示，FLHS蛋鸡肝脏脂肪变性严重，肝脏颜色偏黄，体积较大，出现大量脂肪空泡，肝脏NAS评分较高，经GBE处理后有所缓解(图1D-E)。此外，FLHS蛋鸡血清中TC和GLU浓度及肝内脂质含量(IHTG和IHTC)均显著升高。相比之下，GBE干预明显掩盖了HFD对FLHS蛋鸡这些紊乱代谢参数的影响，表明HFD对肝脏脂质代谢有调节作用(图1F-G)。血清中ALT、AST和ALP活性通常被用作评估肝损伤的可靠指标。当肝细胞受损时，这些酶从肝细胞进入循环系统，从而增加血清中酶的活性。值得注意的是，与ND组相比，HFD组这些酶明显增加，而HFD+GBE组在GBE干预后表现出明显改善(图1H)。综上所述，上述结果表明GBE对FLHS病理进展有治疗作用。

图1. GBE可减轻HFD诱导的蛋鸡FLHS。

A，体重；B，脏器重量；C，脏器系数(%，脏器重量(g)/体重(g)×100%)；D，肝组织H&E染色代表性显微照片及表型图；E，基于组织学切片评估肝组织非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活动性评分(NAS)；F，血脂和血糖水平；G，肝脂质水平；H，血清肝功能指数。*P  < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

2GBE对FLHS蛋鸡抗氧化活性的影响

有研究指出，GBE通过上调SOD和GSH的表达，抑制ROS的合成，从而发挥保护和抗氧化作用，我们由此测定了蛋鸡肝脏和血清的抗氧化活性。与ND组相比，HFD组蛋鸡肝脏GSH、SOD、T-AOC和GSH-PX活性降低，肝脏MDA含量显著升高。而GBE处理显著提高了肝脏GSH、SOD、T-AOC和GSH-PX活性，降低了MDA活性。有趣的是，在血清中也发现了类似的结果(图2A-E)。GBE导致血清SOD和T-AOC水平升高，MDA水平降低74.2%(图2F-I)。因此，GBE提高了HFD诱导的FLHS蛋鸡的抗氧化能力。

图2. GBE对肝脏和血清抗氧化指标的影响。

A，肝组织GSH含量降低。B，肝组织SOD活性。C，肝组织T-AOC。D，肝组织MDA含量。E，肝组织GSH-PX活性。F，血清GSH含量降低。G，血清SOD活性。H，血清T-AOC。I，血清MDA含量。

3GBE 降低了FLHS蛋鸡肝脏脂质合成基因和炎症因子的表达

为了进一步揭示GBE缓解FLHS的机制，测量了GBE处理组和未经GBE处理的FLHS蛋鸡肝脏脂质从头合成、脂质β-氧化和炎症细胞因子的相关基因表达。与ND组相比，HFD组显著增加了脂肪酸合成酶(FAS)、肝X受体α (LXRα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和碳水化合物反应元件结合蛋白1 (ChREBP1)等脂质合成相关基因的表达水平(图3A)。摄入HFD还显著上调了脂质转运和氧化相关基因的表达水平，如酰基辅酶A氧化酶1 (ACOX1)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、肝脂肪酸结合蛋白(L-FABP)和法尼醇X受体(FXR)(图3B)。除了肝脏脂质过度积聚外，脂肪性肝炎也是FLHS的重要病理特征。HFD增加了炎症细胞因子相关基因的表达水平，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、toll样受体4(TLR4)和核因子κB(NF-κB)(图3B)。GBE干预后，与HFD组相比，处理组脂质合成相关基因FAS、LXRα、甘油-3-磷酸酰基转移酶1(GPAT1)、PPARγ和ChREBP1的表达水平显著降低(图3A)，几种炎症细胞因子标志物TNF-α、IL-6、TLR4和NF-κB的表达水平也显著下调(图3C)，但对脂质转运和氧化相关基因的表达没有影响(图3B)。这些数据支持GBE通过降低肝脏中脂质合成相关基因和炎症细胞因子的表达来减弱FLHS的有效性。  

图3. 补充GBE对蛋鸡肝脏脂质代谢相关基因和炎症因子表达的影响。肝组织中脂质合成(A)、脂质转运和氧化(B)及炎症因子(C)相关基因的相对mRNA表达量。

4GBE的抗FLHS作用与肠道菌群的变化有关

为了评估GBE对FLHS蛋鸡肠道菌群的影响，本研究对蛋鸡盲肠和回肠内容物进行了16S rRNA基因测序。结果发现，GBE对回肠微生物群α-多样性(Shannon指数分析)和β-多样性(PCoA分析)没有显著影响(图4A和B)，并且在属水平上没有观察到差异丰富的分类群(图4C)。相比之下，Shannon分析和主坐标分析(PCoA)均显示三组之间盲肠微生物群存在显著差异(图5A和B)。基于属相对丰度的共现网络分析显示，HFD组有65个节点和231条边，ND组有76个节点和190条边，说明HFD组的细菌网络比ND组复杂。ND组和HFD组的核心属分别包含在7个门和8个门中。值得注意的是，HFD+GBE组仅包含58个节点，110个边和5个门，表明GBE干预逆转了HFD引起的复杂细菌网络(图5C-E)。随后的线性判别分析(LDA)效应量(LEfSe)结果显示，不同组之间盲肠细菌群落存在明显差异。在属水平上，与ND组相比，HFD减少了几种有益菌，如Butyricicoccus、Enterococcus、Flavonifractor、Faecalicoccus、Parabacteroides和Megasphaera，但增加了Intestinimonas、Ruminococcaceae UCG-005、CHKCI001、unclassified Lachnospiraceae和Lactobacillus (图5F)。GBE干预后，未培养瘤胃细菌、未分类Tannerellaceae、Megasphaera和未培养Muribaculaceae的丰度显著增加，但Ruminococcaceae UCG-005、Anaerostipes、Fusobacterium和Christensenellaceae R-7 group的丰度显著降低(图5G)。进一步的相关性分析发现，GBE富集的细菌与FLHS标记物呈显著负相关，与抗氧化能力呈显著正相关，而HFD富集的细菌则相反(图5H)。值得注意的是，Megasphaera是唯一一个在HFD处理下丰度显著降低但GBE干预后丰度显著增加的属(图5F和G)，它与不同FLHS标记物呈显著负相关，包括腹部脂肪重量、腹部脂肪系数、ALT、IHTG、IHTC和血清TG(图5H)。综上，这些数据表明，GBE可能通过调节盲肠微生物群(而非回肠微生物群)，特别是盲肠中Megasphaera的丰度，参与缓解FLHS。

图4. GBE对FHLS蛋鸡回肠微生物多样性和组成没有影响。

A，不同处理组回肠菌群α多样性。数据分析采用非参数Kruskal-Wallis检验。B，各组回肠菌群主坐标分析(PCoA)。根据Bray-Curtis距离，利用OTU丰度数据生成PCoA图，并采用adonis分析统计学显著性。C，各样品前20个属的相对丰度。

图5. GBE对HDF诱导的FLHS蛋鸡盲肠菌群的影响。

A，不同处理组盲肠菌群的α多样性。数据分析采用非参数Kruskal-Wallis检验。B，各组盲肠菌群主坐标分析(PCoA)。根据 Bray-Curtis距离，利用OTU丰度数据生成PCoA图，并采用adonis分析统计学显著性。C-E，基于核心属的肠道微生物共现网络分析(ND、HFD和HFD+GBE组平均相对丰度> 0.1%)。F-G，不同处理组间属水平细菌群落的差异。对数LDA评分阈值为2.0。H，属水平盲肠微生物与代谢紊乱相关指标的Spearman相关性分析。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

5GBE增加盲肠SCFAs浓度

微生物群衍生的SCFAs在缓解MAFLD中发挥重要作用。本研究观察到HFD喂养导致盲肠内容物中SCFAs水平总体降低，特别是乙酸盐和丙酸盐的浓度降低(图6A)。然而，与HFD组相比，GBE处理显著提高了总SCFAs、乙酸盐和丙酸盐的水平。SCFAs浓度与差异丰富微生物的相关性分析显示，HFD+GBE组富集的未培养瘤胃细菌、Megasphaera和未培养Muribaculaceae，ND组富集的Faecalicoccus、Ruminococcaceae UCG-013、未分类Bacteroidales和未培养Ruminococcaceae与SCFAs浓度呈显著正相关(图6B)。相比之下，HFD组富集的Lactobacillus、CHKCI001、未培养Barnesiellaceae、Christensenellaceae R-7 group和未培养Lachnospiraceae与SCFAs浓度呈显著负相关(图6B)。这些结果证明了GBE能够促进产生SCFAs的细菌的生长。

图6. 蛋鸡SCFAs水平的GC-MS靶向代谢组学分析。

A，蛋鸡盲肠内容物中SCFAs的浓度。B，SCFAs浓度与差异丰富细菌的相关性分析。红色表示正相关，蓝色表示负相关。*P  < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

6FMT 可减弱HFD诱导的蛋鸡FLHS

为了研究GBE改变的肠道菌群是否对FLHS有治疗作用，本研究进行了FMT实验。结果显示，HFD诱导的FLHS蛋鸡口服GBE处理供体粪便菌悬液后，其体重、心脏重量、腹部脂肪重量和腹部脂肪比均显著降低(图7A-C)。值得注意的是，与模型组相比，FMT后体积明显减小，颜色由淡黄色向紫红色转变，有效减少了FLHS蛋鸡肝脏脂肪空泡数量(图7D)。FMT组肝脏NAS评分明显低于模型组(图7E)。此外，FMT对血清TC和GLU的改善作用不大，但显著降低了脂质沉积(如血清TG、IHTC和IHTG)和肝损伤(图7F-H)。这些结果进一步支持了GBE缓解蛋鸡FLHS是由肠道微生物介导的。

图7. FMT可减弱HFD诱导的蛋鸡FLHS。

A，体重。B，脏器重量。C，脏器指数。D，肝组织H&E染色代表性显微照片及表型图。E，基于组织学切片评估肝组织非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活动性评分(NAS)。F，血脂和血糖水平。G，肝脂质水平。H，血清肝功能指数。*P  < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

7FMT对FLHS蛋鸡肝脏和血清抗氧化活性的影响

与模型组相比，FMT显著降低了FLHS蛋鸡肝脏MDA活性，肝脏GSH、SOD和T-AOC活性分别显著提高了44.83%、20.95%和172.55%(图8A-E)。同样，FMT显著逆转了HFD对血清SOD、T-AOC和MDA活性的影响(图8F-I)。综上所述，FMT提高了FLHS蛋鸡的抗氧化能力。

图8. FMT对肝脏和血清抗氧化活性的影响。

A，肝组织GSH含量降低。B，肝组织SOD活性。C，肝组织T-AOC。D，肝组织MDA含量。E，肝组织GSH-PX活性。F，血清GSH含量降低。G，血清SOD活性。H，血清T-AOC。I，血清MDA含量。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

8FMT对FLHS蛋鸡肝脏脂质代谢基因表达及炎症因子的影响

对FLHS蛋鸡肝脏的qPCR分析显示，FMT显著降低了脂质合成相关基因FAS、LXRα、GPAT1、PPARγ、SREBP-1c、SCD1和ChREBP1的表达水平(图9A)，提高了炎症细胞因子相关基因TNF-α、IL-6、TLR4和NF-κB的表达水平(图9C);然而，与脂质转运和氧化相关的基因的表达水平没有受到影响(图9B)。综上所述，FMT抑制了FLHS蛋鸡的脂质合成和炎症反应。

图9. FMT对FLHS蛋鸡肝脏脂质代谢相关基因及炎症因子表达的影响。肝组织中脂质合成(A)、脂质转运和氧化(B)及炎症因子(C)相关基因的相对mRNA表达量。  

讨论

作为一种天然抗氧化剂，GBE已被报道可通过帮助身体抵抗有害的氧化应激和减少炎症细胞和炎症细胞因子的浸润而有益于健康。目前，GBE因其优异的降脂作用被广泛应用于减轻肥胖、MAFLD等代谢性疾病，而GBE抗FLHS的药理机制尚不清楚。本研究发现GBE的抗FLHS作用与鸡肠道菌群的重塑有关。 本研究表明，GBE干预可消除FLHS蛋鸡肝脏脂肪变性、炎症和肝损伤，并提高抗氧化活性。这些治疗效果在很大程度上符合治疗MAFLD的推荐标准。有趣的是，GBE在FLHS蛋鸡中的抗FLHS功能通过FMT转移到新的受体，这进一步表明GBE的抗FLHS作用与其对肠道微生物群的调节有关。本研究为解释GBE的代谢益处提供了新的线索。 在本研究中，通过补充GBE可以有效逆转FLHS模型脂质代谢紊乱，这与之前报道的GBE可以抑制肥胖大鼠肝脏脂质积累的事实一致。FAS、SREBP-1c、GPAT、PPARγ、LXRα、SCD1和ChREBP1是参与脂质从头合成的关键基因。FAS是催化脂肪酸合成的关键酶。SREBPs是调节胆固醇和脂肪酸生物合成和摄取的重要转录因子。GPAT1是合成甘油磷脂和甘油三酯的限速酶。PPARγ主要促进脂肪生成和前脂肪细胞分化，其上调有助于肝脂肪变性。LXRα作为一种配体依赖性核受体，可与SREBP-1c形成正反馈回路，促进肝脏脂肪生成，并通过LXREs与其启动子区域结合直接激活靶基因ACC、FAS和SCD1。在本研究中，GBE通过显著下调肝脏FAS、LXRα、GPAT1、PPARγ和ChREBP1基因的表达抑制脂质合成，从而减轻FLHS蛋鸡的脂肪堆积。 脂肪酸积累不仅是FLHS的特征，还会引起胰岛素抵抗、脂质过氧化、肝损伤、炎症反应和能量代谢紊乱。有研究发现，棕榈酸在肝脏中过量沉积可激活NF-κB，引起炎症反应。TLR4在肝星状细胞(HSCs)中表达，它通过NF-κB激活和NF-κB依赖性基因的进一步表达引发炎症样反应。TNF-α是最重要的一线细胞因子，它刺激和诱导ROS的产生和脂质过氧化，并激活氧化应激反应基因，放大和延长炎症。同时，炎症过程中释放的氧自由基和TNF-α也可以激活和诱导NF-κB，进而上调TNF-α的表达，参与免疫和炎症反应。值得注意的是，TNF-α可诱导肝脏Kupffer细胞释放IL-6，从而阻碍TG的转运和分泌。另一方面，TNF-α升高可导致肝脏TG积累和脂肪变性，进而激活NF-κB，形成加重肝损伤的恶性循环。结果表明，添加GBE可显著降低FLHS蛋鸡血清ALT、AST和ALP活性，减轻肝损伤。同样，TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-6的表达水平下调，这与以往GBE通过降低NF-κBp65、TNF-α和IL-6的表达来改善炎症的研究一致。本研究的结果和前期研究结果表明，GBE可以抑制TNF-α、IL-6和TLR4-NF-κB通路的激活，从而减轻炎症级联效应和组织损伤。 氧化应激引起肝脏脂质代谢紊乱，也是肝脏相关疾病的重要机制。研究表明，氧化应激及其引发的脂质过氧化可加剧自由基连锁反应，激活炎症介质。MDA活性常被用作自由基诱导的脂质过氧化的标志和氧化损伤的指标，它可与NF-κB相互作用，增加TNF-α的释放。作为一种初级防御，SOD可降低炎症介质的激活和氧化应激。有报道称，SOD治疗可显著降低溃疡性结肠炎患者的脂质氧化，改善结肠炎症。值得注意的是，GBE是一种具有SOD样活性的自由基清除剂，它通过增强SOD活性来减少CCL4诱导的肝纤维化中的脂质过氧化。GSH、T-AOC和GSH-PX是评估氧化应激程度的常用指标。在本研究中，GBE处理显著提高了肝脏和血清中SOD和T-AOC的活性，降低了MDA的含量，表明GBE提高了机体的抗氧化能力，有效抑制了HFD诱导的脂质过氧化。 肠道菌群及其代谢产物在宿主代谢中起着重要作用。本研究结果表明，饲粮中添加GBE可显著逆转HFD诱导的FLHS蛋鸡肠道菌群失衡，将GBE改变的肠道菌群移植至FLHS蛋鸡体内可改善肝脏脂肪变性、炎症和抗氧化。这一结果强烈提示GBE的抗FLHS作用与其调节肠道菌群有关。有趣的是，Megasphaera是唯一一个被HFD显著降低而被GBE富集的属，并且与FLHS性状呈显著负相关。Megasphaera是专性厌氧、革兰氏阴性细菌，属于厚壁菌门、Negativicutes纲、Veillonellales目和Veillonellaceae科。研究发现，Megasphaera是灵长类动物不同生命阶段肠道菌群的优势属，也是成人肠道菌群长期发育的关键驱动因素。从人类肠道中分离出来的Megasphaera被发现含有大量的碳水化合物活性酶和寡肽转运系统，使人们能够利用碳水化合物，以及广泛的氨基酸作为碳源。这些能力使Megasphaera在肠道微环境中具有竞争优势，特别是当微环境发生变化时。先前的研究表明，Megasphaera能够产生SCFAs，包括乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐、己酸盐、异丁酸盐、异戊酸盐和异己酸盐。尤其是Megasphaera可以代谢乳酸和缓冲脂肪生成乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐。这些SCFAs可能通过降低胆固醇生物合成和增加胆汁酸排泄来调节脂质水平。最近的一项研究表明，饲粮中添加Lactobacillus delbrueckii可以通过增加结肠中Megasphaera等细菌的丰度和丁酸盐含量来降低生长肥育猪的血清TG水平。另一项研究表明，Megasphaera在降低高脂血症动物的血脂方面发挥着重要作用。与HFD诱导的猴子相比，耐高脂饮食的食蟹猴(HFD-T)中Megasphaera的丰度显著增加。值得注意的是，移植HFD-T猴的粪便微生物群后，HFD诱导的大鼠中Megasphaera的丰度也显著增加，这种增加趋势与猴子一致。所有这些事实表明，Megasphaera可能对脂质代谢相关疾病有有益的作用。因此，作者推测Megasphaera可能在FLHS的治疗中发挥了关键作用，值得进一步研究。

结论

综上所述，GBE能有效改善蛋鸡脂肪变性、抗氧化活性、炎症反应和FLHS。本研究也证明了这些影响可能是由GBE改变的肠道微生物群介导的。本研究为GBE治疗FLHS及相关代谢疾病提供了基础证据，并为控制鸡肠道菌群设计和开发新的治疗策略提供了线索，以预防和控制蛋鸡FLHS。

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