携手抗癌丨医工结合典范，原研技术可期，为重大疾病早期精准诊断助力！

北京时间2023年9月10日，由美中抗癌协会（USCACA）与中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会联合主办的“携手抗癌丨Anti-cancer Together (ACT) online forum of special topics系列线上活动”第十二期如约而至！

本次第十二期活动特别邀请美国乔治城大学医学院裴华东教授担任会议主持，上海交通大学生物医学工程学院丁显廷教授作了主题为“单细胞精密蛋白测量技术及临床应用”的会议报告。现整理会议报告与讨论精要，以飨读者。

主题报告

行业写照：意义大、问题多、有挑战

丁显廷教授首先对自己的专业领域进行了简单介绍。丁教授所在的上海交通大学生物医学工程学院隶属于工学部，主要研究方向是为临床和医学基础科研创造更便捷有效的平台和工具。在当下所倡导的“面向人民生命健康”国家战略的背景下，该学科领域具有非常重大的意义。

丁教授团队的探索方向之一是如何对一些重大疾病做到早期精准诊断。为了实现这一目标，就需要解决如何利用极为有限的临床样本实现多重功能蛋白检测的关键技术问题。丁教授解释道，人体单个细胞中已编码的蛋白种类数量在19000~20000种左右，这其中某个或某一些蛋白的异常表达都会导致人体疾病的发生、发展。而在临床上，个体患者能够提供用于检测的细胞样本量往往是非常有限的，因此在疾病的早期诊断中个体化用药以及治疗后复发转移的评估过程中，用这些少量的样本去开展非常多的蛋白联合检测就成了一个现实问题。目前这个问题在行业和领域内都是很难的问题，原因在于即便在单个细胞内，所含物质的种类和数量也非常多，这就意味着检测的干扰很大，同时真正功能蛋白的丰度又往往非常低，蛋白检测也不能像核酸检测一样使用PCR等方式扩增。因此微量（单）细胞开展精密功能蛋白检测是全球普遍挑战。

丁教授进一步介绍道，虽然目前在行业内和临床上有一些常用的检测技术，但均存在着一些局限。例如单细胞测序技术检测的是核酸水平，并不严格等同于蛋白水平。再例如临床检验科中应用较多的流式细胞仪技术。该技术一般用来标记细胞膜表面蛋白来进行细胞分型，而对于细胞内部甚至细胞核内部的功能蛋白的检测上存在困难。目前检测细胞内功能蛋白的金标准是蛋白免疫印迹（WesternBlot）技术，但该技术也存在问题，无法做到单细胞灵敏度的检测，所需细胞量大，且重复性差。因此，想要实现快速、低丰度、多重的功能蛋白检测仍需要新的技术平台，且具有挑战。

自研技术的创新之路

丁教授致力于解决这一关键技术问题，多年来带领团队在WesternBlot的底层技术基础上，做了很多创新工作。重点在于提高单细胞检测灵敏度并实现稳定可重现。丁教授首先回顾了WesternBlot的技术流程。传统WesternBlot的三个主要步骤分别是一级电泳、转模和抗体赋予。在前两者的过程中，样本在电泳液中浸泡时间过长，会导致部分蛋白溶解或纵向弥散出现蛋白条带的重叠；同时转模的不彻底也会造成信号丢失。这些都是传统免疫印迹技术的瓶颈。

创新技术-光敏凝胶

为了克服这些技术瓶颈，丁教授在如何缩短时间、如何避免转模两个方面展开了针对性的思考，并逐步研发出新型电泳凝胶体系，即新型光敏凝胶。这套新凝胶体系有两个突出特点。其一是蛋白质在凝胶中进行电泳时的穿梭效率非常高，传统技术中需要花费7小时才能勉强分离蛋白质，而在新型光敏凝胶上只需20分钟即可达到相似或更好的效果。第二个突出特点是将蛋白分离后，进行20秒的光照即可将蛋白固定在凝胶原位，进而直接实现胶内抗体赋予和检测。整体过程在2~3小时内即可完成。同时由于过程中几乎没有蛋白损失，因而样本量可以非常小。

丁教授透露，目前该技术已经实现了使用单个细胞裂解液进行对多重蛋白的分析。这种光点击固定蛋白策略，在化学上属于点击化学的领域，相关技术在2022年被授予了诺贝尔化学奖，从侧面也印证了新型光敏凝胶核心技术的合理性和可靠性。

创新技术-芯片与探针

在新型光敏凝胶的创新基础上，丁教授团队又进一步探索了如何提高检测通量。他们通过将新型光敏凝胶材料直接进行微纳加工，研发出了一种可以同时处理上万个单细胞的分析芯片，同时细胞流失率不超过1%，极大地提高了单细胞精准诊断的能力。

但是，由于这种分析芯片非常致密，所以在传统抗体的赋予和过量抗体洗脱上存在困难，增加了信号假阴性和假阳性的风险。针对这一问题，丁教授团队设计了一种抗体捕获蛋白的“抓手”体系，使用多肽或适配体取代传统抗体，实现了单细胞检测成本的大幅度降低，并提高了检测的稳定性。

然而，新的问题随之而来。多肽和适配体比抗体要小，如何保证它们对于靶标蛋白的亲和力和特异性呢？丁教授团队使用了计算机辅助结构设计技术，计算了上万条多肽或适配体序列，获取了更特异、更稳定的“抓手”。并且设计了基于单细胞高维度蛋白数据的细胞族群分析算法，可以更精准地鉴定出疾病发生、发展相关的稀有痕量细胞族群（rare cell subset），为在临床上应用奠定了基础。特别是在肿瘤类疾病这样复杂的细胞群中，通过这一算法，可以将稀有的、小的细胞族群精准分类。这在疾病的早期诊断、早期分型以及选择用药的场景下，对于寻找小细胞族群的生物标志物，具有非常好的指导意义，有利于跟踪疾病的发生与发展过程。

创新技术-算法与软件

既往临床在为疾病或肿瘤分型时，往往仅关注到了单个蛋白。当有了以上技术，能够获得很多个蛋白的检测结果时，就可以不再用某一个蛋白去评价一种复杂疾病的发生发展，而是通过分析某一类型蛋白异常表达所伴随的另一类型蛋白协同高表达或协同低表达，建立蛋白表达的拓扑学网络，通过系统性评估来更精准地描绘和跟踪复杂疾病的发生与发展。

通过以上的创新工作和努力，丁教授团队建立了完整的检测系统，将WesternBlot的金标准技术的检测时长由两天缩短至2小时，将上样量由万级数量的细胞缩减至单细胞，对临床小样本的研究和分析提供了非常好的技术平台。在国家的大力支持下，这样的检测系统已经完成装备化，完全自主开发、国产原研，具备高通量、单细胞、低丰度、快时效和低成本等提点，并且已经开始了实际应用。在单次可检测上万个细胞、同时可分析8个以上靶蛋白、检测时间小于2小时和抗体选择达到3000种这4项关键指标上均处于国际领先地位。

技术助力临床，创新推动发展

丁教授团队近年来利用生物医学工程技术与临床医院开展了广泛合作，在报告中充分分享了三个案例可谓转化医学的典范，为临床疾病诊断和治疗提供了新的思路和帮助。

报告总结

报告最后，丁教授做了简单总结。相较于传统繁琐的检测手段，丁教授团队研发的单细胞多重功能检测技术在WesternBlot这一金标准的底层原理的基础上，有效缩短了检测时间，减少了样本需求量，并且增加了检测精准性。有望对更多的临床问题和疾病诊疗提供新的解决思路和帮助。

讨论环节

主题报告后的讨论环节，大会主持裴华东教授高度评价了丁教授团队所做的工作，肯定了丁教授团队通过生物医学工程学技术，自主研发检测系统、搭建硬件平台、编码软件算法，打造出了令人震撼的单细胞精密蛋白测量系统，同时在为产品化做持续的努力，给临床疾病诊断提供了新颖思路和有效手段。

随后裴教授邀请美国埃默里大学的孙士勇教授和线上同道与丁显廷教授一起进行学术探讨，并就丁教授团队研发的单细胞精密蛋白测量技术在放大样本量、临床应用成本、其他肿瘤标志物检测以及应用在肿瘤分型时的具体细节等方面问题和相关研究内容进行了热烈讨论。

三位教授均期待未来能有更多合作交流的机会，并以此孕育出更好的转化医学成果，为癌症患者早期诊断和治疗带来新的希望。

审阅丨同济大学附属上海市肺科医院 苏春霞

编辑丨中国医学论坛报 胡岳

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