DNA聚合酶的分类与结构

DNA聚合酶在20世纪80年代的发展给生物技术领域带来了革命性的变化，DNA聚合酶的多重适应性导致了广泛的标准程序，包括高保真PCR、套式PCR、多重PCR、定量PCR（qPCR）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、全基因组扩增等。基因组的复制和维护依赖于大量复杂的DNA流程，这些流程涉及不同的蛋白质和DNA底物。随着对不同DNA聚合酶了解的不断加深，它们性质上的微妙差异与其生理作用密切相关。

1. 三个生命领域的DNA聚合酶

生命的三个领域：细菌、古细菌和真核生物已经进化出不同的DNA聚合酶来复制它们的基因组。细菌基因组的前导链和之后链都是由两个Pol-Ⅲ（C家族）拷贝复制，一个Pol-Ⅰ（A家族）使冈崎片段成熟并去除RNA引物。

在真核生物中，已知细胞至少含有15种不同的DNAP。染色体复制主要由DNA聚合酶 α、δ 和 ε（Polα、Polδ 和 Polε）完成。所有这些DNAP都是多聚体，含B家族的催化亚基、调节亚基和各种辅助亚基，在DNA复制中起到关键作用。

所有古生菌都含有Pol B（B家族），它与真核生物复制性DNA的催化亚基同源，在同一多肽链中同时含有聚合酶和3′→5′校对活性。

2. DNA聚合酶家族与结构域

2.1 家族分类

根据蛋白质序列，DNA聚合酶分为A、B、C、D、X、Y、RT（逆转录酶、端粒酶）和PrimPol-（灵长酶和聚合酶）家族。A-D家族大部分成员为复制聚合酶，有3′→5′核酸外切酶活性，具有校对作用，但少数具有减少或失活的3′→5′核酸外切酶活性参与翻译合成（TLS）和小间隙填充修复合成（sGRS）；X家族聚合酶执行与碱基切除修复（BER）和非同源末端链接（NHEJ）相关的sGRS；Y家族成员通过整合与受损碱基直接相反的核苷酸专门参与TLS；RT家族的端粒酶利用自身RNA亚基模板可合成许多端粒重复序列；PrimPol家族的独特之处在于它可以合成DNA引物并在没有RNA引物的情况下继续DNA合成。

2.1.1 A家族

A家族原型来源于大肠杆菌PolⅠ，是第一个被分离且结构被解析的酶。最初，PolⅠ被认为是细菌细胞中主要的复制聚合酶，后续发现它与DNA修复和冈崎片段成熟有关。为辅助完成上述作用，除DNA聚合活性外，还含有3′→5′/5′→3′核酸外切酶活性。3′→5′核酸外切酶活性被称为校对活性，可去除聚合酶错误插入的核苷酸。

2.1.2 B家族

真核生物的主要复制酶属于B家族，与大多数A家族酶一样，大多数B家族酶含有相关的3′→5′核酸外切酶活性。然而与其它家族成员不同，B家族聚合酶是多亚基酶，Pols δ和ε共同承担复制高等真核生物基因组中数十亿个碱基对的艰巨任务。当其辅助蛋白存在时，两者都是最忠实和持续行进的酶。除了Pols α、δ和ε之外，真核生物还含有一个额外的 B 家族蛋白：Pol ζ，但这种酶相对不忠实，并且进行碱基配对时，出错率更高。

2.1.3 X家族

X家族聚合酶是小的单体聚合酶，大多数家族成员在N端存在一个8kDa DNA结构域，可在DNA修复过程中填补短间隙。X家族酶中研究最多的是Pol β，它通过BER过程参与碱基损伤的修复，其它包括参与V(D)J 重组过程的三种酶：Pol λ、Pol µ和模板独立的末端脱氧核苷酸转移酶等。V(D)J 重组是一种特殊的末端连接反应，发生在免疫系统细胞的抗原受体基因位点上，负责抗原识别位点的多样化。而X家族成员也存在于缺乏免疫系统的生物体中，例如酵母、病毒或细菌。

2.1.4 Y家族

Y家族聚合酶的发现源于人们认识到大肠杆菌蛋白UmuC/UmuD′和DinB编码DNA聚合酶。Y家族聚合酶有几个共同的特征，它们都不含外切酶活性，有一个手腕或小手指结构域（PAD）。Y家族酶在未损伤DNA上的合成保真度较低。与其他家族中的聚合酶不同，Y家族成员对新生碱基对有一个松散的DNA结合袋，因此，这些酶可以在其活性位点容纳扭曲的DNA结构，从而使这些酶能够在受损的DNA上聚合。Y家族聚合酶的主要作用似乎是在DNA损伤耐受途径中。如果细胞无法修复可能干扰复制过程的DNA损伤，并且这些损伤被复制叉遇到，则Y家族聚合酶可以通过在受损部位聚合绕过这些损伤，这一过程被称为翻译合成。

2.2 结构域

每个家族（D除外）最常见的特征是具有手掌、拇指和手指区域的右手，但Y家族聚合酶具有一个额外的小指结构域（LF，也称为聚合酶相关结构域），它对于DNA结合至关重要；而PrimPol成员则缺少明显的拇指结构域 。所有DNA聚合酶的催化中心都位于手掌结构域，通常包含三个羧酸酯，尽管各家族序列、拓扑结构大不相同，但拇指域始终结合DNA底物，并且手指结构域结合模板和传入新生碱基对。

3. DNA聚合酶复制准确的决定性因素

3.1 构象选择

构象选择最初被称为诱导配合，是指当dNTP与模板碱基形成配对时，从手指开放域DNA结合的二元复合体到手指闭合域聚合酶-DNA-dNTP三元复合体的结构变化过程。这种变化是因为新生碱基对选择性稳定了闭合构象。而受损的模板碱基、传入的核糖核苷三磷酸及受损或不匹配的dNTPs会破坏三元复合体的稳定性，并导致手指域持续开放。在封闭的三元复合体中，聚合酶无缝接触碱基表面和新生碱基对，DNA和dNTP完全对齐，发生化学作用。

3.2 DNA合成反应和Mg2+介导的化学选择

在DNA合成反应中，聚合酶-DNA-dNTP三元配合物需要捕获三个催化Mg2+离子。第一个Mg2+离子占据B位点，并将DNA聚合酶与进入的dNTP结合在一起，但如果dNTP和模板碱基不匹配，这种结合会迅速逆转。只有在dNTP正确的情况下，第二个Mg2+离子才会占用A位点。在复制聚合酶中，A位点Mg2+的结合与构象选择同时发生。与两个Mg2+离子结合的聚合酶-DNA-dNTP三元配合物产生反应，但是直到第三个Mg2+离子占据C位点被dNTP捕获，新的磷酸二酯键才形成。活性位点组成、DNA或dNTPs的轻微改变会对Mg2+结合产生巨大影响，从而影响DNA合成反应。Mg2+介导的反应准确性高，显著降低DNA合成错误率，形成了化学选择的基础。

3.3 校对

校对3′→5′核酸外切酶活性位于A和B家族复制聚合酶的同一条肽链上，或作为单独的亚基存在。模板或引物对的错配削弱了DNA与聚合酶活性位点的结合，并触发DNA的校对。DNA底物在聚合酶和核酸外切酶之间的精细分配提高了保真度，不会降低DNA合成的进程和效率。

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