ADC分析策略的万花筒

抗体-偶联药物（ADC）

由细胞毒性药物和抗体通过连接子连接。ADC结构的复杂性和异质性以及体内释放的低浓度细胞毒性药物对其生物分析提出了巨大的挑战。了解ADC的药代动力学行为、PK/PD和TK是成功开发的必要条件。因此，需要建立准确的分析方法来评估完整的ADC、总抗体、释放的小分子细胞毒素和相关代谢物。选择合适的生物分析方法进行综合分析主要取决于细胞毒性药物的性质、化学连接子和附着位点。由于配体结合试验和质谱相关技术的提高，使我们对ADC整体的药代动力学信息了解的更全面、更透彻。本文将重点讨论用于ADC药代动力学研究的生物分析方法，并讨论其优点、目前的局限性和潜在的挑战。

01简介

ADC的分子结构如图1A所示。与抗体类药物相比，ADC的结构更具复杂且具有异质性。设计ADC的初衷是通过单抗的靶向性，将有效载荷运载到靶组织或靶细胞进而释放，同时，在正常组织中暴露较少，以期提高肿瘤治疗的剂量和安全窗。

图1A ADC结构示意图

ADC与肿瘤细胞表面的高表达蛋白（靶抗原）通过单克隆抗体特异结合生成ADC-抗原复合物，然后通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，进入肿瘤细胞释放药物，杀死肿瘤细胞。ADC的代谢及作用机制如图1B和1C所示。

图1B ADC体内代谢示意图

图1C ADC体内作用机制

ADC的抗体部分应该能够选择性的与图1中特异性表达或过表达的抗原分子结合。ADC有效载荷的细胞毒性应该非常高，这样在ADC分布到实体肿瘤组织后，有效载荷可以在细胞中在低浓度时杀死肿瘤细胞。与抗体分子相关的细胞毒性药物数量有限，因此，与相应的单克隆抗体相比，毒素分子对ADC的药代动力学特性没有特别大的影响。ADC是一种具有不同药物抗体比（DARs）的异质混合物。ADC的DAR值在体内发生动态变化。此外，ADC的连接子应该在体循环中足够稳定，一旦ADC进入靶细胞内，连接子应立即释放小分子细胞毒性有效载荷杀死癌细胞。

到目前为止，全球范围内ADC的在研信息有310余条，这些药物大多处于临床早期阶段，15种ADC获批上市（见表1），13种候选药物进入临床III阶段，156种和137种药物处于临床前阶段和临床Ⅰ期。了解ADC的药代动力学特征是其开发、优化和临床应用的必要条件和重要条件。

表1已获批上市ADC药物汇总

表2 ADC药物药代动力学特征

ADC药代动力学研究的准确分析方法应监测不同种类的分析物，如完整的ADC、偶联的小分子毒素、总抗体、游离的小分子毒素及其相关代谢物。选择合适的分析方法进行综合分析，主要与化学连接子、小分子细胞毒素和附着位点的性质有关。目前，无标记生物分析法和标记生物分析法是测定血浆或组织中ADC衍生化合物的两种主要生物分析方法。无标记生物分析主要是指配体结合分析（LBAs）或基于质谱（MS）的方法再或者上述分析方法的结合。在大多数标记ADC的情况下，放射性同位素或荧光报告物应被纳入有效载荷或/和单克隆抗体的结构中。ADC在体内的变化可以通过像正电子发射断层扫描（PET），单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和荧光分子断层扫描来监测（FMT）。

02用配体结合法分析ADC

配体结合分析（Ligand-binding assays,LBA）方法是最常用的定量ADC药物中的抗体部分的策略，包括定量总抗体（total antibody）和偶联抗体（conjugated antibody）。该平台在相对较低的实验和仪器成本下具有灵敏度高，通量高且稳定的特点，并且可供参考的相应法规体系很完整。LBA可以通过设计特定的检测形式（assay format），满足不同的检测需求。

该反应的最后一个时间点显示了在不同的生物样本中监测的分析物的数量。生物样本中的分析物可以被大多数以抗体为关键试剂的LBA捕获和检测。酶联免疫吸附试验（ELISAs）是LBA检测生物样本中不同分析物的金标准。单克隆抗体（mAbs）和多克隆抗体（pAbs）是LBAs中首选的关键试剂。

图2 LBA分析示意图

ADC的药效和毒性与抗体偶联药物、游离药物和总抗体有关，总抗体含量应同时监测。对于ADC的分析，通常选用LC-MS/MS对毒素小分子进行分析，选用LBA对分子量较大的总抗或抗体偶连药物进行分析。例如，有科学家开发了基于ELISA技术的生物分析方法，用于测定小鼠血浆中的MC-MMAF偶联物和抗CD22-MCC-DM1。为了分析总抗CD22抗体，抗体用CD22胞外结构域（ECD）捕获，并用山羊抗人IgG Fc辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗体GxhFc-HRP检测。对于药物偶联的抗CD22抗体的分析，分别采用重组CD22ECD和抗DM1或抗MMAF生物素化抗体分别作为捕获试剂和检测试剂。

LBA的优点是成本低、高通量、易于实现和高灵敏度。

LBA的缺点总结如下：

（1）LBA不能检测ADC的DAR值；

（2）LBA对检测ADC代谢物的敏感性有限；

（3）用抗体捕获和检测分析物的选择性不高；

（4）LBA不能提供关于ADC的化学结构和序列的全面信息；

（5）在LBA中使用的抗体具有潜在的交叉反应性；

（6）开发LBAs抗体的时间很长。

03基于LBA-LC-MS/MS结合分析法分析ADC

LBA-LC-MS/MS是ADC生物分析的又一种方法。采用LBA和LC-MS/MS结合方法对ADC的有效载荷进行生物分析方法如下：首先，通过相应的通用捕获试剂、抗有效载荷来捕获adc的偶联有效载荷；第二，在洗脱后，用胰蛋白酶或组织蛋白酶-b酶消化ADC的共轭有效载荷；第三，用LC-MS/MS法检测了酶切生成的多肽。为了避免内源性人IgG的干扰，通常选择来自可变区域的独特肽来检测ADC。可选择抗人Fc抗体作为免疫亲和捕获试剂，捕获并纯化生物基质中的目标抗体，从而提高了LBA-LC-MS/MS混合检测的特异性和敏感性。图3显示了LBA/LC-MS/MS混合分析的程序。

图3 LBA/LC-MS/MS混合分析的程序

LBA-LC-MS/MS混合方法具有高灵敏度、高选择性等优点。此外，该方法还可以提供DAR和药物负荷等有价值的ADC结构信息。此外，LBA-LC-MS/MS混合检测也存在成本高、数据解释复杂、仪器操作复杂、通量低、检测完整ADC的灵敏度低等缺点。

04质谱法分析ADC的有效载荷

LC-MS/MS分析由于其高选择性和高灵敏度，是一种有效检测ADC有效载荷的技术。通常选择固相萃取（SPE）和有机溶剂蛋白质沉淀作为样品制备方法，在色谱分离前去除生物基质中的蛋白质。LC-MS/MS检测的定量下限应该要多，因为在生物样品中释放出来的药物的浓度低。使用MS测定ADC具有高选择性、高灵敏度等优点。MS也存在一些缺点，如质谱法容易受到生物样品中非挥发性盐和内源性化合物的影响。

05基于生物标记法分析ADC

ADC在体内的药代动力学也可以用放射性标记技术进行研究。ADC的有效载荷或抗体成分可以用放射性同位素标记。然后，利用正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和荧光分子断层扫描（FMT）等成像技术监测放射性同位素，研究ADC在体内的过程。成像的时间窗可以由标记的放射性同位素的半衰期决定。通过对同位素的监测，可以揭示ADC的生物分布。例如，Mitchell A.Winnik通过PET/CT研究了[89Zr]Zr-去铁氧胺*-T-DM1在Balb/c和NOD/SCID小鼠中的生物分布（图4A）。Niels J. Sijbrandi用PET-CT研究89Zr-曲妥珠单抗、89Zr-曲妥珠单抗-mal-AF和89Zr-曲妥珠单抗-Lx-AF在携带NCI-N87小鼠的药代动力学行为。他们的研究结果表明，这三种ADC的药代动力学和组织分布特性相似。这三种ADC在肿瘤组织中的浓度要高得多，说明ADC具有较好的肿瘤靶向性。

图4A microPET/CT对[89Zr]Zr-DFO-T-Dr和[89Zr]Zr-DFO-T-DM1在不肿瘤携肿瘤的Balb/c小鼠和NOD/SCID小鼠过表达SK-OV-3人卵巢癌异种移植小鼠中（箭头）的生物分布研究。

Susanne Lutje使用SPECT研究了111In标记的ADC在BALB/c裸鼠中的生物分布，皮下注射3天后，可以清楚地观察到不同111In标记的ADC在肿瘤组织中的分布。C.Andrew Boswell通过SPECT-CT研究111In标记的anti-tomoregulin monomethyl auristatin E在雄性C.B-17 SCID beige小鼠中的肿瘤-心脏比值。肿心比随着ADC剂量的增加而降低。

图4B 111In TENB2-MMAE(3mg/kg)在小鼠注射后24h或72h SPECT/CT的生物分布研究。

Parul Gupta等人通过FMT成像技术研究IL13Rα2ADC在A375异种移植物小鼠中的分布和肿瘤靶向潜力。FMT显示了IL13Rα2ADC良好分布曲线。ADC对A375异种移植小鼠有剂量相关的抗肿瘤作用。当剂量为3mg/kg时，完全应答的比例为90%。Giddabasappa等人利用FMT成像技术研究了5T4ADC在雌性nu/nu荷瘤小鼠中的生物分布和肿瘤靶向性。利用FMT成像技术评估生物药物的分布和肿瘤靶向性的方案如图4C所示。对ADC不同成分的双放射性标记也是研究ADC体内行为的一种很好的选择。例如，Joey A.Muns等人通过免疫-PET成像技术研究了双放射性标记曲妥珠单抗-[195mPt]Lx-DFO-89Zr的生物分布和血液动力学。通过195mPt/89Zr双标记，他们的研究结果显示，曲妥珠单抗-[195mPt]Lx-DFO-89Zr在血液中稳定，其肿瘤靶向性良好。

图4c 使用FMT成像评估生物药物的生物分布和靶向性时方案示意图。

用NHS酯化反应对抗体/ADC（生物药物）进行VT680标记。标记后，通过体外方法对VT680偶联的Ab/ADC的VT680标记、稳定性、与抗原结合和细胞毒活性进行定性和/或定量评估。质量控制评估后，通过血液和组织的FMT成像和PK分析，确定体内生物分布和肿瘤靶向性。

Ohad Ilovich等人使用了双同位素CIQA技术研究一个具有111In标记抗体和3H标记的有效载荷MMAE的ADC的生物分布和有效载荷。CIQA可以清楚地显示不同时间点在血液和组织中释放的有效载荷的量（如图5）。

图5 HEK-293GCC2肿瘤（上）和HEK-293肿瘤（下）切片，在注射示踪剂后1小时(A)、24小时(B)和96小时(C)切除。

H信号为红色，111In信号为绿色，两个共配信号均为黄色。HEK2-293GCC2在24小时的图像显示药物最初从抗体积累部位扩散并深入肿瘤。

Cahuzac等人使用双放射性标记和体外数字成像技术来监测ADC的体内行为（图6），该ADC被3H和14C双标记。这些研究证实了双放射性标记用于ADC药代动力学研究的可行性。此外，液体闪烁计数器（LSC）是一种放射性仪器，它使用液体闪烁体接受辐射并将其转换为荧光光子。它是ADC药代动力学研究的有用工具。LSC可以对生物样品的总辐射和放射性进行定量。

图6 4T1肿瘤切片的体外双放射成像可以使给药后[3H/14C]-21小时(A)或6小时(B)的两种成分进行定量（n=3只小鼠/每次）。

图7 LSC工作原理

06ADC生物分析面临的挑战及展望

ADC是一种新型抗癌药物。由于ADC的复杂性和异质性及其在体内的动态变化，ADC的药代动力学也相应复杂，这给ADC的生物分析带来了巨大的挑战。ADC的生物分析应同时关注完整的ADC、总抗体、释放的小分子细胞毒素及相关代谢物。因此，需要对ADC进行预标记的分析方法（如PET和PMT）和无标记的分析方法（如基于LBA和MS的分析）已被广泛应用于ADC的药代动力学研究。

生物分析技术的未来发展，特别是基于质谱的新技术的应用，可以支持更准确和全面的分析ADC的体内变化。通过不同分析技术的结合，可以更好、更深入地了解ADC的药代动力学行为、暴露-安全性/有效性关系，这对ADC的设计和开发具有重要意义。

参考文献：

1.Lei Y,Aiyun X,Yumeng Z, et al. Bioanalytical assays for pharmacokinetic and biodistribution study of Antibody-Drug Conjugates.[J]. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals,2023.

2.Qiuping Q,Likun G. Current Analytical Strategies for Antibody–Drug Conjugates in Biomatrices[J]. Molecules,2022,27(19).

3.Yue H,J C N D,Kemal B, et al. Multifaceted Bioanalytical Methods for the Comprehensive Pharmacokinetic and Catabolic Assessment of MEDI3726, an Anti-Prostate-Specific Membrane Antigen Pyrrolobenzodiazepine Antibody-Drug Conjugate.[J]. Analytical chemistry,2020,92(16).

4.Abdollahpour-Alitappeh M, Lotfinia M, Gharibi T, Mardaneh J, Farhadihosseinabadi B, Larki P, Faghfourian B, Sepehr KS, Abbaszadeh-Goudarzi K, Abbaszadeh-Goudarzi G, Johari B, Zali MR, and Bagheri N (2019) Antibody-drug conjugates (ADCs) for cancer therapy: Strategies, challenges, and successes. J Cell Physiol 234:5628-5642.  

作者：乘船远航

编辑人：💧Transparent

来源：医药速览

2023-09-13

打赏