科研丨MICROBIOL RES: 褪黑素减轻慢性间歇性缺氧引起的小鼠肠道屏障功能障碍(国人佳作)

编译：微科盟蔚蓝

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读  

慢性间歇性缺氧(CIH)在全身性低度炎症之前触发亚临床肠道屏障破坏。越来越多的证据表明褪黑素对全身炎症和肠道微生物群重塑具有治疗作用。但褪黑素是否以及如何减轻CIH引起的肠道屏障功能障碍尚不清楚。本研究对C57BL/6J小鼠和Caco-2细胞系进行处理，使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的葡聚糖分光光度法评估肠道屏障功能。采用免疫组织化学和免疫荧光染色检测机械屏障的形态变化。蛋白质印迹法(WB)和qRT-PCR揭示紧密连接、信号转导和转录激活因子3(STAT3)的表达水平。16S rRNA分析结肠内容物的微生物群。使用流式细胞术检测细胞因子和Th17细胞。结果发现，CIH可诱导结肠粘膜损伤，包括杯状细胞数量减少和肠道紧密连接蛋白表达降低。CIH可降低有益菌属梭菌属(Clostridium)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)和拟杆菌属(Bacteroides)的丰度，并增加致病菌属脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的丰度。最后，CIH在体外通过信号转导和转录激活因子3(STAT3)的磷酸化促进Th17分化，并升高体内循环促炎细胞因子。

补充褪黑素可改善上述CIH诱导的肠粘膜损伤、肠道菌群失调、肠道Th17极化和全身性低度炎症反应。

综上所述，褪黑素通过调节肠道菌群失调、粘膜上皮完整性和通过STAT3信号传导的Th17极化，从而减轻CIH诱导的肠屏障功能障碍。

图文摘要

论文ID

原名：Melatonin attenuates chronic intermittent hypoxia-induced intestinal barrier dysfunction in mice

译名：褪黑素减轻慢性间歇性缺氧引起的小鼠肠道屏障功能障碍

期刊：Microbiological Research

IF：6.7

发表时间：2023.8

通讯作者：关建，许华俊，吴晓林

通讯作者单位：上海交通大学医学院附属第六人民医院；上海市第八人民医院

DOI号：10.1016/j.micres.2023.127480

实验设计

结果

1.褪黑素对CIH改变小鼠体重、体长、摄入量和细胞因子水平的影响 

所有小鼠在连续10周接受或不接受褪黑素治疗的CIH暴露后均存活(图1A)。CIH处理2周后，体重显著降低，而口服补充30 mg/kg褪黑素5周后，体重显著增加(图1B)。在建模早期和中期，固体和液体摄入量的变化几乎与体重成正比(图1C，D)。CIH暴露显著降低了CIH组的体长(图1E)。CIH+MT小鼠的体长与对照组相似，尽管前者看起来更瘦(图1F)。

本研究发现CIH组的血清褪黑素水平显著降低(下降近24.2%；p<0.001)，在口服补充褪黑素后恢复到正常水平(图2A)。与CON组相比，CIH组促炎细胞因子的基因表达显著增加，例如IL-1β增加了46%(p<0.001，图2B)，IL-6增加了41%(p=0.003，图2C)，TNF-α增加了36%(p<0.001，图2E)，TGF-β增加了26%(p<0.001，图2F)，IL-17A增加了169%(p<0.001，图2G)、IL-17F增加了38%(p<0.001，图2H)、IL-21增加了125%(p<0.001，图2I)、IL-22增加了148%(p<0.001，图2J)、IL-23增加了59%(p=0.002，图2K)和CCL20增加了115%(p<0.001，图2L)，抗炎细胞因子IL-10基因表达减少19%(p<0.001，图2D)。相反，与CIH组相比，CIH+MT组血浆促炎细胞因子减少，如IL-1β减少17%(p=0.025，图2B)、IL-6减少18%(p=0.01，图2C)、TNF-α减少18%(p=0.006，图2E)、TGF-β减少26%(p=0.08，图2F)、IL-17A减少39%(p=0.002，图2G)、IL-17F减少21%(p<0.001，图2H)、IL-21减少9%(p=0.01，图2I)、IL-22减少35%(p<0.001，图2J)、IL-23减少24%(p=0.002，图2K)和CCL20减少33%(p=0.045，图2L)，而CIH+MT组中抗炎IL-10水平增加了11%(p=0.003，图2D)。这些结果表明，外源性褪黑素显著改善了CIH诱导的炎症。

图1.研究设计和基线数据。

(A)研究设计和CIH干预流程，补充或未补充褪黑素(CON组，n=8；CIH组，n=10；CIH+MT组，n=10)。(B)补充或未补充褪黑素CIH暴露期间的体重。补充或未补充褪黑素CIH期间小鼠的平均每日食物(C)和水(D)摄入量。建模结束时小鼠的全身照片(E)和体长(F)。使用Mann‐Whitney U检验评估体重和摄入量的组间差异。使用方差分析评估组间体长的差异。数据表示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，CON组和CIH组间比较。#p<0.05，##p<0.01和 ### p<0.001，CIH和CIH+MT组间比较。

图2.CIH对小鼠血清褪黑素分泌及细胞因子基因表达的影响。

(A) ELISA法测定血清褪黑素水平。使用抗体阵列测定补充或未补充褪黑素的CIH暴露小鼠血清IL-1β(B)、IL-6(C)、IL-10(D)、TNF-α(E)、TGF-β(F)、IL-17A(G)、IL-17F(H)、IL-21(I)、IL-22(J)、IL-23(K)和CCL20(L)的相对表达水平(CON组，n=8；CIH组，n=8；CIH+MT组，n=8)。数据表示为平均值±SEM。使用方差分析评估组间差异。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，CON组和CIH组间比较。#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，CIH和CIH+MT组间比较。

2.褪黑素在CIH与小鼠肠粘膜形态和通透性关系中的中介作用

在小鼠处死前4小时灌胃FITC-葡聚糖来评估肠道屏障功能。图3A显示，与常氧条件小鼠相比，CIH和CIH+MT小鼠的光密度分别增加2.7倍和显著降低(p<0.001)。CIH组结肠长度明显缩短(19.3%；p=0.008)(图3B-C)。H＆E染色(图3D)显示粘膜上皮和固有层受损；此外，CIH组中大量炎症细胞浸润粘膜下层邻近区域。AB-PAS染色(图3E-F)显示，CIH组中储存和分泌酸性粘多糖的杯状细胞数量显著减少。使用扫描电镜评估肠道通透性和细菌易位(补充图1)。WB分析表明CIH小鼠结肠组织中ZO-1、occludin和claudin-1(图4A-B)的表达水平分别降低了64.7%(p<0.001)、89.2%(p<0.001)和75.3%(p<0.001)。补充褪黑素显著增加了这些紧密连接蛋白的数量，特别是ZO-1和claudin-1，与CIH组相比增加了1.2-3.1倍(p<0.01)。在补充或未补充褪黑素的CIH暴露下使用免疫荧光检测ZO-1、occludin和claudin-1蛋白。与Con组相比，CIH组中3种紧密连接蛋白在各个层面似乎都有所减少。补充褪黑素后，红色荧光比CIH组染色更多。染色不能被认为是非常特异性的，但其显示出与WB分析相似的趋势。代表性图像如图4C所示。

图3.褪黑素对CIH小鼠肠道通透性、结肠长度和形态以及杯状细胞数量的影响。

(A)根据光密度(每组n=4)评估CIH联合和不联合褪黑素处理后对4.4 kDa FITC-葡聚糖的肠道通透性。CON(n=8)、CIH(n=10)和CIH+MT(n=10)组结肠外观照片(B)和结肠长度(C)的比较。(D) 使用和不使用褪黑素处理的CIH小鼠结肠组织切片的HE染色(比例尺：200或20 μm)。CON、CIH和CIH+MT组结肠组织的AB-PAS染色(比例尺：50 μm)(E)和每μm2杯状细胞数量(F)。数据表示为平均值±SD。使用方差分析评估组间差异。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，CON组和CIH组间比较。#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001，CIH和CIH+MT组间比较。    

图4.褪黑素对CIH小鼠紧密连接蛋白(ZO-1、occludin和claudin-1)表达的影响。

(A-B)使用Western blotting评估CON、CIH和CIH+MT组结肠ZO-1、occludin、claudin-1和β-肌动蛋白水平。相对蛋白水平标准化为β-肌动蛋白水平(每组n=4)。(C)有或无褪黑素处理的CIH小鼠结肠紧密蛋白的免疫荧光染色(红色：ZO-1、occludin和claudin-1；蓝色：DAPI；每组n=4)。使用方差分析评估组间差异。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，CON组和CIH组间比较。#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001，CIH和CIH+MT组间比较。

3.褪黑素对CIH改变小鼠肠道微生物群组成的影响

16S rRNA高通量测序表征了结肠微生物群的组成，这些微生物群被聚类为特征性操作分类单元。补充图2显示了三组中肠道菌群的丰富度和多样性。分层聚类揭示的β多样性和组间相似性的主坐标分析(PCoA)图如图5A-B所示。CIH显著降低了拟杆菌门的丰度，显著上调了厚壁菌门、变形菌门和放线菌门的种群数量以及厚壁菌门/拟杆菌门比率。外源性褪黑素显著减弱了这些细菌门丰度的增加(图5C-H)。此外，细菌属的分析表明，补充褪黑素显著逆转了CIH引起的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)和Duboslella丰度的变化(图6A)。基于三个群落中代表性细菌分类群的线性判别分析效应大小(LEfSe)结果(图6B)，CIH暴露显著增加了病原体脱硫弧菌属和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的水平(图6C，F)，并降低了梭菌属(Clostridium)、阿克曼氏菌属(Akkermansia)和拟杆菌属的水平(图6D-E，G)。此外，估计了补充褪黑素对CIH相关微生物群失调的影响，发现褪黑素显著降低了革兰氏阴性菌和潜在致病菌的丰度，但促进了耐应激细菌的表达(图6H-J)。

图5.补充或未补充褪黑素的CIH小鼠在门水平上的结肠微生物群组成。

使用微生物群操作分类单元生成的PCoA图(A)和UPGMA聚类分析的PCoA图显示，CON和CIH组沿PCoA2轴分离，而CIH和CIH+MT组沿PCoA1轴分离。(B)分层聚类显示，CIH组和CON组的差异大于CIH组和CIH+MT组的差异。(C) CON、CIH和CIH+MT组的Bray-Curtis相似度指数。条形图显示了每个门的丰度。(D-H) CON、CIH和CIH+MT组中四个主要门和厚壁菌门/拟杆菌门比率。数据表示为平均值±SD (CON组，n=8；CIH组，n=10；CIH+MT组，n=10)。使用Mann‐Whitney U检验评估组间差异。*p<0.05，CON组和CIH组间比较。#p<0.05，CIH组和CIH+MT组间比较。    

图6.补充或未补充褪黑素的CIH小鼠属水平的结肠微生物群组成。

(A) Circos图显示了CON、CIH和CIH+MT组中五个最丰富的肠道细菌属。属评估结果显示，CIH显著上调乳杆菌属和脱硫弧菌属，Muribaculaceae和Duboslella属下调。(B)由LEfSe序列分析获得的分类分支图。显示了CON、CIH和CIH+MT组之间结肠差异丰富分类群。使用临界值≥2.0进行线性判别分析。根据LEfSe结果，肠道微生物群中脱硫弧菌属(C)、梭菌属(D)、阿克曼氏菌属(E)、双歧杆菌属(D)和拟杆菌属(G)的相对丰度。实线和虚线分别表示平均值和中位数。CON、CIH和CIH+MT组中革兰氏阴性菌(K)、潜在致病菌(L)和耐应激细菌(M)的相对丰度。数据表示为平均值±SD(CON组，n=8；CIH组，n=10；CIH+MT组，n=10)。使用Mann‐Whitney U检验评估组间差异。*p<0.05，CON组和CIH组间比较。#p<0.05，CIH组和CIH+MT组间比较。  

4.褪黑素抑制Th17极化以改善CIH诱导的啮齿动物肠道免疫屏障功能障碍

研究了褪黑素对CIH相关免疫功能障碍的有益作用。对CIH和CIH+MT组抗体阵列中差异表达基因的KEGG和基因本体生物学过程(GO-BP)分析显示(图7A-B)，炎症性肠病、Th17细胞分化、STAT级联和JAK-STAT信号通路显著富集。LPMCs的流式细胞术分析显示，与对照组相比，CIH小鼠结肠中的Th17亚群增加了2.49倍(p<0.001)(图8A-B)。褪黑素处理显著降低了Th17细胞的比例，从8.42%降至4.05%(p<0.001)。在Th17细胞关键转录因子RORγt mRNA的表达中也观察到类似的模式(图8I)。此外，对Th17细胞极化至关重要的p-STAT3的表达在补充褪黑素的CIH小鼠中降低了77.8%(p<0.001)(图8C-D)。还使用免疫组织化学染色评估了主要的Th17相关致病细胞因子IL-17A和IL-23的相对浓度(图8E-H)。与CIH组中的高表达相反，褪黑素给药显著降低了啮齿动物结肠中IL-17A和IL-23的相对表达水平，分别降低了70.9%和88.4%(p<0.001)。10周的CIH暴露通过增加p-STAT3的表达促进肠道Th17极化，导致Th17相关促炎分子如IL-17A和IL-23的分泌增加。褪黑素治疗完全逆转了小鼠结肠的上述变化。

图7.细胞因子抗体阵列中差异表达基因的富集。

有或无褪黑素处理的CIH小鼠血清样本中差异表达细胞因子基因的KEGG(A)和GO_BP(B)富集分析。P值以渐变(从红色到绿色)表示。气泡的大小反映了富集程度。    

图8.褪黑素对CIH小鼠结肠Th17分化的影响。

(A) CON、CIH和CIH+MT组固有层CD4+T细胞中IL-17+表达的代表性流式细胞术图。(B) Th17细胞的定量(每组n=4)。(C-D) Western blotting检测CON、CIH和CIH+MT组结肠p-STAT3、STAT3和β-肌动蛋白的产生。相对蛋白质水平标准化为β-肌动蛋白水平(每组n=4)。(E-H)有或无褪黑素处理的CIH小鼠结肠Th17细胞下游促炎效应分子(IL-17A和IL-23)的免疫组织化学染色(比例尺：20 μm；每组n=4)。(I) CON、CIH和CIH+MT组结肠组织中RORγt、JAK1、JAK2、JAK3、TLR2、TLR4、NF-κB、MAPK、PI3K/Akt、AMPK和SIRT1 mRNA的相对表达水平(每组n=4)。数据表示为平均值±SD。使用方差分析进行组间比较。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，CON组和CIH组间比较。#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001，CIH和CIH+MT组间比较。

5.褪黑素通过抑制STAT3信号传导抑制CIH条件下的Th17分化 

为了了解褪黑素的Th17抑制依赖性作用，在体外检测了CIH存在时外源性褪黑素在Th17极化条件下对naïve CD4+ T细胞的影响。为了阐明在CIH存在的情况下JAK2/STAT3在CD4+ T细胞分化中的作用，在Th17极化条件下给予JAK2/STAT3抑制剂、STAT3信号激活剂和褪黑素。

IL-17A是成熟Th17细胞的特征标志物，本研究中评估了IL17A的水平以确认分化过程的效率。CIH组培养物上清液中IL-17A水平明显高于CON组(图9A)，在第3天达到357 pg/mL的峰值。STAT3 mRNA表达也发现了类似的结果(图9B)。CIH暴露3天后，Th17细胞的比例显著上调(图9C-D)。CIH+JAK2/STAT3抑制剂组中CD4+ T细胞中的JAK2/STAT3抑制显著下调Th17极化、STAT3 mRNA表达和IL-17A分泌，类似于CON组中这些指标水平的变化。与褪黑素给药相比，JAK2/STAT3抑制剂对逆转CIH诱导的Th17分化更有效。此外，如ELISA、qRT-PCR和流式细胞术结果所示，在CIH+MT+STAT3激活剂组中，向CD4+ T细胞添加STAT3信号激活剂显著降低了褪黑素对CIH诱导的Th17极化的改善作用(图9)。此外，作者评估了JAK2/STAT3抑制剂、STAT3激活剂和褪黑素在Caco-2细胞中的疗效，发现褪黑素对CIH诱导的肠粘膜上皮损伤的保护作用是由STAT3抑制介导的(补充图3)。这些结果为JAK2/STAT3在给予或未给予褪黑素的CIH条件下CD4+ T细胞分化中的作用提供了见解。CIH通过激活JAK2/STAT3信号通路加速Th17分化，而褪黑素通过阻断该通路抑制CIH诱导的Th17分化。

图9.褪黑素可减弱体外CIH期间Th17的分化。

Naïve健康新生小鼠脾脏CD4+ T细胞(CD3+CD4+CD45RA+CD45RO-)在褪黑素、JAK2/STAT3抑制剂和STAT3激活剂存在的CIH下在Th17条件下分化3天。(A)体外分化过程中IL-17A(Th17细胞表达标志物)的水平。(B)体外极化过程中naïve CD4+ T细胞中STAT3 mRNA相对表达量的实时qRT-PCR分析。(C) Th17条件下门控CD4+ T细胞中IL-17+表达的代表性流式细胞术图。(D) CON、CIH、CIH+MT、CIH+JAK2/STAT3抑制剂和CIH+MT+STAT3激活剂组中的Th17细胞定量(每组n=4)。数据表示为平均值±SD。使用方差分析比较组间差异。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，CON组和CIH组间比较。#p<0.05，##p<0.01和###p<0.001，CIH组与CIH+MT组、CIH+JAK2/STAT3抑制剂组和CIH+MT+STAT3激活剂组的比较。      

讨论

肠道屏障在肠道和全身稳态的维持中至关重要，且对缺氧尤为敏感。CIH可能与肠屏障功能障碍的发病和加重有关。本研究发现CIH可能引发肠粘膜、微生物和免疫屏障功能障碍，从而导致体内和体外的全身性炎症。额外补充褪黑素可通过抑制STAT3信号传导来调节肠道菌群失调、粘液上皮完整性和Th17极化，从而逆转CIH诱导的肠道屏障损伤。 

CIH影响结肠粘膜厚度和外观，CIH诱导后紧密连接膜蛋白和FITC-葡聚糖循环水平升高。这些结果表明，CIH破坏了肠道机械屏障并使结肠通透性增加。肠道屏障破坏也降低了消化和吸收的能力，这与CIH小鼠的体重减轻和发育迟缓相一致。既往研究发现紧密连接对缺氧敏感，其中缺氧诱导因子信号的缺失会导致紧密连接功能丧失和上皮屏障破坏。 

本研究的微生物组成分析显示，CIH小鼠粪便微生物组的多样性和丰富度显著下降。CIH显著降低梭菌属的丰度，梭菌属参与了天然色氨酸吸收和转化为吲哚代谢物，包括褪黑素。在一定程度上，梭菌属丰度的下降减少了褪黑素的合成。此外，CIH暴露下阿克曼氏菌属和拟杆菌属的种群显著下调，这与肠道杯状细胞和细胞间紧密连接的减少有关。此外，CIH组中的优势分类群属于变形菌门和放线菌门，对应于脱硫弧菌属和双歧杆菌属。双歧杆菌通过发酵产生内源性乙醇。细菌乙醇直接提高肠道通透性，并作为Toll样受体(TLRs)的配体加速慢性炎症。激活的TLRs(模式识别受体)显著增加促炎因子的表达水平，例如IL-1β、IL-6和TNF-α，激活NF-κB和JAK-STAT通路；反之，这会在炎症期间激发致病性CD4+ T细胞。 

本研究发现，CIH小鼠结肠中循环细胞因子水平升高，肠道Th17聚集和增殖。在刺激IL-6和TGF-β产生的生理条件下，粘膜Th17细胞通过中性粒细胞和巨噬细胞的趋化作用调节肠道完整性，进而刺激上皮细胞产生抗菌肽。这些肽在肠粘膜维持方面发挥重要作用。然而，在病理条件下，例如CIH诱导的肠漏和潜在的促炎微环境，Th17细胞分泌炎症介质，促进炎症的进展，使预后恶化。Th17细胞在炎症性肠病中发挥核心作用，并依赖于下游效应细胞因子的产生。IL-23受体通过JAK2下游信号传导进一步激活下游效应物(STAT3或MAPK)，诱导IL-17的产生。与此一致，本研究发现IL-17A、IL-23、p-STAT3和JAK2在CIH小鼠结肠组织中的表达显著上调，表明CIH通过JAK2/STAT3信号通路促进病理性Th17细胞介导的肠道免疫屏障功能障碍。此外，高循环水平的Th17相关细胞因子和CCL20/MIP-3α参与了CIH诱导的细菌易位和Th17激活、迁移而产生的促炎反应。既往研究发现Th17亚群迁移到关节以加速炎症。因此，CIH过度激活的Th17细胞会触发促炎细胞因子和趋化因子的表达，导致肠道和外周炎症。 

有趣的是，除了CIH诱导的肠屏障损伤之外，本研究发现体外补充褪黑素可通过抑制JAK2/STAT3信号传导显著抑制Th17极化，维持Th17平衡，增强抗炎作用和肠道细胞更新，改善CIH诱导的肠道机械屏障功能障碍。褪黑素具有抗氧化和抗炎作用。此前的研究报告了Th17和调节性T(Treg)细胞与炎症性疾病进展和结局存在拮抗关系，并发现褪黑素可通过激活AMPK/SIRT1信号通路影响Th1/Treg细胞比例，从而改善肠道屏障。褪黑素通过对NADPH氧化酶、促炎介质、一氧化氮(NO)和内皮NO合酶的影响来预防CIH诱导的高血压和内皮功能障碍。褪黑素还可以改善受损的Ca2+稳态、心肌损伤和缺血再灌注损伤易感性，进而防止CIH诱导的心肌功能障碍。褪黑素可能通过抑制缺氧诱导的增殖细胞核抗原、缺氧诱发因子-1a和核因子-jB的表达并通过降低升高的心室收缩压来预防缺氧性肺动脉高压。此外，褪黑素可以通过激活SIRT1介导的自噬信号通路来改善FD/CIH诱导的肝细胞损伤。 

有多篇论文试图探索CIH、肠道菌群、结肠通透性和肠道炎症之间的关系。这些关系错综复杂且其中机制至今仍不清楚。肠道包含三个要素：上皮、适应性免疫系统和微生物组。其中每一种成分在维持健康和疾病病理生理中都发挥着至关重要的作用。这三种成分也受外部环境和危重疾病的影响，反过来又繁殖病理宿主。据报道，CIH是肠道机械屏障和肠道通透性的风险因素。CIH导致微生物群多样性降低、炎症和肠道屏障干扰相关菌株增加。CIH促进肠道微生物群的特异性改变，进而引发免疫改变，导致OSA诱导的终末器官疾病。CIH小鼠粪便微生物群移植(FMT)表现出嗜睡增加(阻塞性睡眠呼吸暂停的标志)和肠道通透性增加。 

本研究聚焦于CIH相关肠道屏障功能障碍和促进JAK2/STAT3信号传导，以提高人们对褪黑素有益作用机制的理解。尽管本研究评估了几种表型和褪黑素作用的机制，但并未用JAK2/STAT3信号通路过度激活和JAK2/STAT3条件敲除小鼠模型验证褪黑素的作用。此外，参与信号通路的其他分子也需进一步探索。褪黑素对CIH模型安全有效，因此，应在OSA的大规模临床试验中将其作为辅助治疗进行评估。    

结论

综上所述，CIH暴露通过抑制褪黑素分泌进而影响肠道屏障完整性、肠道微生物菌落、肠道免疫微环境和全身促炎反应。褪黑素或许可作为抗炎剂，通过抑制STAT3信号传导调节肠道菌群失调、粘膜上皮完整性和Th17极化，从而逆转CIH诱导的肠屏障功能障碍。