孙超主任团队解读：急性肝损伤中【嗜酸性粒细胞】的肝脏募集及其保护功能

2019年肝病领域顶刊JOH指出，世界范围内每年大约有200万例患者死于肝脏疾病，我国约有700万肝硬化患者，每年新发肝癌46万，乙丙肝感染者逾1亿，为社会带来沉重的医疗和经济负担。

为契合《“健康中国2030”规划纲要》中提出的将重大慢性疾病过早死亡率较2015年下降30%的目标，肝胆相照平台与天津医科大学总医院消化内科联合打造“肝研撷萃”精品栏目。

“肝研撷萃”由天津医科大学总医院孙超主任担任总编辑，范晓飞博士、惠洋洋博士、王晓雨博士、崔膑心博士任执行编辑，通过研读分享各种肝脏疾病诊断、治疗、预防和发病机制的前沿进展，结合团队自身的工作，为广大医生提供精进学术、助力临床的交流平台。

“肝研撷萃”第二十五期，孙超主任团队分享发表于JOH的一篇文章，进一步解读急性肝损伤中嗜酸性粒细胞的肝脏募集及其保护功能，以启迪临床。

研究背景

急性肝损伤临床常见，病因包括缺血/再灌注、病毒感染、自身免疫和药物不良反应，部分病例进展为肝衰竭，除肝移植外欠缺有效的治疗手段，因此阐明其发病机制，探究内源性的保护手段至关重要。嗜酸性粒细胞传统上被认为参与了过敏性疾病的发生发展和抗寄生虫感染，但最近有越来越多的证据表明其同样在促进组织修复和抗炎方面发挥着重要作用。

既往研究报道在不同的病生理条件下，例如病毒性肝炎、DILI和肝移植排斥反应中都发现了嗜酸性粒细胞在患者肝脏组织中聚积，基础研究也提示在缺血/再灌注肝损伤模型中，嗜酸性粒细胞起到了强大的保护效应。但是机体通过何种机制将嗜酸性粒细胞募集到损伤病灶，也就是确切的分子生物学途径仍不清楚。

实验结果

1、APAP处理后，嗜酸性粒细胞在肝脏内聚积

过量摄入的对乙酰氨基酚（APAP）是临床上急性肝衰竭的原因之一。与对照组的肝活检组织相比，APAP肝损伤患者的嗜酸性粒细胞数量显著增加。（图A、B）

APAP肝损伤小鼠肝脏组织中嗜酸性粒细胞的百分比和绝对数量都增加，并在48小时达到峰值。（图C-E）

2、嗜酸性粒细胞可预防急性肝损伤

APAP处理WT和嗜酸性粒细胞缺陷（ΔdblGata1）小鼠。

ΔdblGATA1小鼠在24小时内出现更严重的肝损伤，血清ALT水平升高和肝细胞坏死增加。此外，将WT骨髓来源的嗜酸性粒细胞（BmEos）转移到ΔdblGata1小鼠体内，再进行APAP处理，结果发现血清ALT水平和肝坏死程度显著降低。（图A-C）

即使将BmEos转移推迟到进行APAP处理后的8-12小时，ΔdblGata1小鼠的肝损伤程度仍然明显减轻。（图D-F）

3、IL-33促进肝脏嗜酸性粒细胞以巨噬细胞依赖的方式募集

本研究假设损伤相关分子模式（DAMPs）可能在激活巨噬细胞募集嗜酸性粒细胞中发挥重要作用，进而设计相关实验验证HMGB1、IL-1α和IL-33这三种DAMPs是否会触发嗜酸性粒细胞向肝脏组织募集。

外源性IL-33，而不是IL-1α和HMGB1诱导嗜酸性粒细胞向肝脏募集。（图A、B）

APAP处理后血清IL-33水平显著升高，进一步说明IL-33在介导的肝损伤过程中发挥募集作用。（图C）

对IL-33敲除（IL-33-/-）小鼠进行了APAP诱导的急性肝损伤。与WT小鼠相比，IL33-/-小鼠在损伤后肝内嗜酸性粒细胞募集显著减少。（图D-F）。

4、肝窦内皮细胞是APAP肝损伤过程中释放IL-33的主要来源

流式细胞术分析确定了2种IL-33阳性细胞类型（用APAP处理IL-33-GFP小鼠，24小时后分离肝细胞和肝脏非实质细胞），其中肝窦内皮细胞（LSECs，CD45-CD146+）约占IL-33+细胞的65%，其余35%为CD45+F4/80+巨噬细胞。（图A）

耗竭巨噬细胞，发现对血清IL-33水平没有影响，这一结果也证明了肝窦内皮细胞是APAP肝损伤过程中释放IL-33的主要来源。（图B）

5、IL-33在巨噬细胞产生CCL24中发挥着重要作用

趋化因子CCL11和CCL24都被广泛报道具有嗜酸性粒细胞特异性，进一步的实验用来阐明是哪种物质在肝损伤中主要发挥募集作用，以及IL-33在诱导巨噬细胞激活过程中扮演的角色。

APAP处理后，CCL11的mRNA和蛋白水平均未改变，CCL24的mRNA和蛋白水平显著增加，但是耗竭巨噬细胞后，CCL24蛋白水平又显著降低。（图A-D）

APAP处理过的IL-33-/-小鼠的血清CCL24水平明显低于WT小鼠。（图E）

外源性IL-33可诱导小鼠产生CCL24，但在巨噬细胞耗竭的小鼠中则不能发挥相应作用。（图F）

6、IL-33通过激活嗜酸性粒细胞释放IL-4，间接促进巨噬细胞产生CCL24

体外用IL-33处理骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），IL-33没有直接诱导CCL24的释放。（图A）

进一步研究鉴定了表达IL-33受体ST2的细胞类型，流式结果显示几乎所有的ST2+细胞都是嗜酸性粒细胞，而在嗜酸性粒细胞存在的条件下，巨噬细胞才会表达CCL24。（图B、C）

用IL -33刺激的嗜酸性粒细胞中收集的条件培养基（CM）培养BMDMs，显示能够诱导CCL24产生，以上结果均提示IL-33激活的嗜酸性粒细胞释放的可溶性因子十分关键，而既往IL-33已被证实能够刺激嗜酸性粒细胞释放IL-4和IL-13。为确定IL-4/IL-13是否在巨噬细胞产生CCL24中起关键作用，作者在CM中添加抗IL-4/抗IL-13中和抗体。（图D）

中和IL-4可以抑制巨噬细胞产生CCL24，而中和IL-13不能。在培养BMDMs 24小时后，CM中的IL-4消失、IL-13未显著变化，表明IL-4被巨噬细胞消耗了。此外，用相同浓度的IL-4/IL-13处理BMDMs，在Stat6激活方面，IL-4诱导的反应明显比IL-13强。（图E-G）

总结

本研究阐明在多种急性肝损伤模型中嗜酸性粒细胞能够被募集到病灶，进而发挥重要的保护作用。来源于肝窦内皮细胞的IL-33直接作用于嗜酸性粒细胞，启动其与巨噬细胞之间的正反馈“对话”。IL-33激活嗜酸性粒细胞释放IL-4，IL-4再诱导巨噬细胞产生CCL24，最终募集更多的嗜酸性粒细胞到达损伤灶发挥保肝效应。

主编点评

各种急性和慢性肝脏疾病已经对人类健康和医疗资源造成了极大影响和负担，近期发表在Clin Gastroenterol Hepatol的一篇综述提到估计全球有1.13亿人口感染丙肝，3.16亿人口感染乙肝，12.3亿罹患有NAFLD，而酒精性肝病则占据了肝脏疾病死亡病例总数的27%和肝癌相关死亡的30%。

此外，由于人口老龄化以及多重用药的问题，药物性肝损伤甚或相关肝衰竭的发生率也在不断攀升，而多种肝病的重叠存在也使临床医生在处理这类患者时倍感棘手。虽然不同病因造成的急性肝损伤进展速度、潜在机制以及预后转归相异，但是一旦发展到脏器衰竭阶段，除肝移植外并无有效的治疗手段。

本文作者结合前期自身研究基础和临床上观察到多种病生理条件下嗜酸性粒细胞在肝内损伤灶聚积且具备强大保护作用，为阐明内在机制设计了相关实验，本期分享的文章有如下亮点：

1、动物实验中CCl4、APAP和ConA都被用来诱导急性肝损伤，但其作用机制迥异，考虑到实验结果的可靠性和外推性，本研究同时使用了上述三种模型，再结合以往利用缺血/再灌注肝损伤的结果，充分证实了嗜酸性粒细胞在不同条件下的强大保肝作用。

2、本研究设计严谨、逻辑链条环环相扣，利用嗜酸性粒细胞缺陷小鼠、IL-33敲除小鼠、结合巨噬细胞耗竭、嗜酸性粒细胞转移，同时结合流式细胞术以及体外利用条件培养基和相关中和抗体，充分验证了IL-33/IL-4/CCL24轴，以及嗜酸性粒细胞/巨噬细胞之间的正反馈“对话”拮抗急性肝损伤的完整分子生物学机制。

3、实验结果回答了既往研究中存在争议的几个问题：

•IL-33到底是募集嗜酸性粒细胞到达肝脏组织还是促进骨髓来源的祖细胞分化为嗜酸性粒细胞；

•IL-33在肝损伤过程中的细胞来源是哪里；

•IL-33是直接还是间接作用于巨噬细胞，如果是间接作用，那么嗜酸性粒细胞通过何种关键分子发挥中介效应。

展望

本研究报道的嗜酸性粒细胞与巨噬细胞进行“对话”，进而发挥肝脏保护作用具有重要意义，嗜酸性粒细胞释放的IL-4能够促进脂肪组织中巨噬细胞M2型转化，从而维持机体内环境中的葡萄糖稳态，由此推想，这一作用可能在代谢相关脂肪性肝病的治疗中也占据一席之地。

此外，目前临床实际使用且疗效确切的保肝药物种类有限，更欠缺能够早期遏制疾病进展、防止肝脏衰竭行之有效的手段，借鉴CAR-T（嵌合抗原受体T细胞免疫疗法）这种调动内源性免疫机制在肿瘤治疗所取得的巨大成功，靶向嗜酸性粒细胞治疗各种类型的肝损伤无疑是副作用小，极具潜力和前景的方法。

主编介绍

孙超，副主任医师，本科毕业于北京大学医学部，天津医科大学医学/理学博士，日本兵库医科大学研究员。全国疑难及重症肝病攻关协作组（CNSLD）第五届全国委员。主持完成国家自然科学基金一项。担任SCI期刊Journal of Clinical and Translational Hepatology编委，Gene Expression编委，任职Portal Hypertension & Cirrhosis首届学术委员会。2020年在EASL（欧洲肝脏研究学会）年会做口头发言，2021年在AASLD（美国肝病研究协会）年会做壁板展示，2023年在JSH（日本肝脏学会）总会代表CHESS做特邀发言。获得EASL的“Full Bursary”和APDW的“Travel Grant”奖励。以通讯作者在Clinical Nutrition, Liver International, Cell Death & Disease, Hepatology Communications等杂志发表SCI文章60余篇，他引1049次，h指数19，研究成果被ASGE（美国胃肠内镜学会）和EASL发布的临床实践指南引用。目前研究方向为调节性细胞死亡在急慢性肝损伤中的作用机制，体成分异常、营养不良、衰弱、睡眠障碍以及微量元素对肝硬化预后的影响及干预措施。

作者介绍

杨婉婷，天津医科大学八年制临床医学专业，硕士研究生在读。以第一/共同第一作者身份在JPEN、Nutrition等杂志发表SCI文章7篇，目前研究方向为慢性肝病与营养不良、肌肉减少症和微量元素之间的关系。

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