核酸适体的飞跃进化，期待兼具高药效和安全性的新型血栓症治疗药

对血栓症的分子靶向药物开发至关重要的凝血素和纤维蛋白原相互作用抑制

日本东京大学于8月8日宣布，成功开发出了一种通过添加互补链DNA等实现药效中和的核酸适体，其药效大大超过了血栓症现有的低分子治疗药物。

该研究是由该大学大学院综合文化研究科的吉本敬太郎准教授、奈良县立医科大学血栓止血医药生物学共同研究讲座的坂田飞鸟特任助教等人组成的研究小组进行的。研究成果发表在《Molecular Therapy - Nucleic Acids》上。

血液凝固反应在血管内失控的话会增加血栓的风险。凝血因子之一的凝血素与基质纤维蛋白原反应，引起血液凝固。血栓症是血管内血液凝固引起的疾病，一旦发生血栓，血流停止，就会引起严重的症状。预防和治疗血栓症时使用的药物被称为抗凝药，它与生物体内的凝血因子结合，抑制凝血。与凝血酶结合，阻碍凝血酶和纤维蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用的分子具有抑制血液凝固的分子靶向药物的巨大潜力。

HIT药物Argatroban面临安全性挑战

另外，肝素诱发血小板减少症（HIT）是一种使用肝素（一种抗凝剂）而引起的血栓症治疗并发症，是一种与血小板减少一起引起血栓栓塞症的疾病。由于最近新型冠状病毒感染的大流行，肝素的使用量增加了HIT患者的数量。不幸的是，目前作为HIT治疗药物使用的低分子凝血素抑制剂Argatroban，由于没有中和剂来停止严重的出血，这是一种副作用，而且它具有胎盘通过性，所以对孕妇来说不推荐使用，在安全性方面留下了课题。

着眼于通过互补链实现药效停止和连接的“核酸适体”

在这样的背景下，研究小组致力于开发研究可用于血栓症预防和治疗药物的安全性高的核酸适体。核酸适体是中分子型分子靶向药物之一，是具有分子识别功能的单链核酸，包含

（1）制造成本低廉，

（2）运输、保管时不用低温管理，

（3）可以通过互补链停止药效（中和），

（4）容易连接多个适体（双重特异性化）等特点。特别是

（3）核酸适体特有的核酸适体可以降低使用抗凝药时担心的出血风险，从而开发安全性高的血栓症治疗。而且，中分子药物核酸的胎盘通过性极低。

具有高抗凝血活性的“M08s-1”

结合作为血液凝固因子的凝血酶原的DNA适体，自1992年首次通过SELEX法发现由被称为HD1的15个碱基序列构成的凝血酶原结合性DNA适体（TBA15）以来，获得并报告了各种序列的适体。研究小组以前用自行研制的MACE（R）-SELEX方法获得了10个针对凝血酶的DNA适体组“M系列”，其中发现了DNA适体史上具有最高抗凝作用的M08及其短链序列M08s-1。

M08s-1引入双重特异性，制备4种适体，结合亲和性提高约100倍

该研究小组通过充分利用核酸适体的特点——多个适体的连接（双重特异性化），设计了基于M08s-1的双特异性适体。Antithrombin适体已经被报道过，它是通过柔软的单链DNA将抗凝血活性较低的TBA15和TBA29结合在凝血酶外细胞1上，TBA29结合在外细胞2上。大部分是由单链或刚直的双链型DNA连接的。

通过改变接头种类（连接2个适体的单链核酸或双链核酸）和适体的组合，对含有M08s-1的4种双间隔适体进行了新的设计和制作，并进行了评价。首先，对凝血酶的结合亲和性进行评价，结果表明，对人凝血酶和鼠凝血酶的结合亲和性，4种全部比单体适体 M08s-1提高约100倍。

在小鼠中表现出高7～10倍的抗凝活性和5倍的血中半衰期

用老鼠做动物实验的结果显示，HIT的批准药Argatroban，单体适体，BsAb适体等摩尔量的老鼠静脉注射后，用回收的血浆比较抗凝活性。BsAb适体明显高于Argatroban和已有临床候选适体 NU172的抗凝活性，其中Lin08-08和Pse08-29的抗凝活性比M08s-1高7到10倍。在老鼠体内发现了这种现象。有趣的是，两种单体适体 NU172和M08s-1在3分钟后的分布阶段血液浓度迅速下降，而在二聚体中并没有迅速下降。抗凝活性最高的是Pse08-29，而血中半衰期最长的是Lin08-08，大约是单体适体血中半衰期的5倍。Pse08-29在老鼠体内表现出比其他三种双聚体aptmer更强的抗凝活性，具体的机制目前还不清楚，不过利用了独自发现的M08s-1，二聚体化的作用很大。这很有可能与提高的目标分子的结合亲和性有关。

可以用短的互补链序列和硫酸蛋白来中和活性

用于HIT治疗的Argatroban和Bivalirudin没有中和剂，因此治疗时的出血风险较高。另一方面，由于补充链的添加，使高阶结构强制转变为双链成为可能，因此可以利用补充链作为中止药效的中和剂。使用短互补链序列[M08sG2]c进行人血浆中作为中和剂的功能评价时，虽然不能完全中和抗凝效果，但成功地将目标aPTT值降低到30以下。此外，他们还发现，使用已经在临床上被批准的硫酸丙胺，可以几乎完全抑制Pse08-29的高抗凝活性。

此次研究成功开发出了天然型双重特异性DNA适体（双特异性DNA适体），其药效大大超过了现有血栓症治疗药物的药效，可以通过添加互补链DNA等来中和药效。

研究小组表示：“此次获得的研究成果，有助于开发安全性高的HIT治疗和血栓症治疗药物，同时，在以血液凝固因子为目标的天然核酸治疗药物的开发中，不引入化学修饰和人工核酸的独特分子设计提供指南。”

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