血癌宣传月：CAR-T细胞疗法研究背后的科学

今年9月是一年一度的血癌宣传月。最近，使用嵌合抗原受体(CAR) T细胞治疗b细胞癌已被监管机构批准。嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法是癌症治疗的革命性新支柱。尽管用CAR-T细胞治疗对B细胞白血病或淋巴瘤的某些亚群产生了显着的临床反应，但许多挑战限制了CAR-T细胞在实体瘤和血液恶性肿瘤中的治疗效果。在本期医学顶刊NEJM杂志中，Chiesa等报告了一项原理验证的临床经验:用来自异基因碱基编辑细胞的杀瘤性嵌合抗原受体(CAR) T细，根除了1例患T细胞淋巴母细胞白血病的女孩的可测量残留病变。值此血癌宣传月之际，让我们通过本项研究抛砖引玉，来深度了解一下CAR-T细胞疗法的研究以及其背后的科学吧。

什么是CAR-T细胞?

CAR-T细胞是一种T细胞，其中引入了编码对肿瘤细胞靶点具有特异性抗体的DNA。然后，表达car的T细胞攻击并杀死表达靶点(即肿瘤相关抗原)的细胞。CAR-T细胞已被证明在血液系统癌症中具有高水平的活性，并且开始在实体瘤中显示出活性。通常，它们由患者自身的T细胞产生。CAR-T细胞的使用面临的挑战包括为每例患者生成CAR T细胞需要数周时间，而且生成的细胞通常只够治疗患者一次。在一些患者中，肿瘤在CAR-T细胞制备过程中发生进展。在一些患者中，部分缓解，人们想知道部分缓解是否可以在另一轮或两轮治疗中变得完全。因此，研究者的目标是获得足够数量的现成效应细胞，以便立即治疗患者并支持重复治疗。同种异体供体可能是这些细胞的来源。然而，使用同种异体供体细胞产生CAR-T细胞的过程因以下事实而变得复杂:宿主将通过“外源”细胞的主要组织相容性复合体(MHC)识别它们并尝试拒绝它们。反过来，被转移的T细胞将视宿主为外源并介导移植物抗宿主反应。

CAR-T细胞与血液系统肿瘤

大多数t细胞ALL患儿可接受标准化化疗方案治疗，但诱导失败或巩固治疗后微小残留病升高的患儿通常会接受异基因干细胞移植。异基因干细胞移植后复发的患者预后不良，长期生存率低于15% 。在这种情况下，细胞免疫疗法有可能实现对白血病的深度清除，但针对T细胞癌的CAR-T策略一直具有挑战性，部分原因是T细胞之间的自相残杀效应和随之而来的长期T细胞淋巴细胞减少症这一严重风险。如果CAR-T细胞活化后抗原下，或者可以利用抗原阴性T细胞亚，则可以在制造过程中避免自相残杀。

如何克服组织相容性问题?

在异基因骨髓移植过程中，通过对宿主的免疫抑制来预防宿主过继转移的外来细胞的排斥反应是临床医学的常规做法(稍后会详细介绍)。为了预防移植物抗宿主病，Chiesa等将过继转移细胞上的细胞表面受体“禁用”，该受体可识别外来(在本例中为宿主)MHC分子:t细胞受体。

CAR-T细胞中的基因能被沉默吗？

是的。基于CRISPR(规律成簇的间隔短回文重复序列)-Cas9新工具，其开放使靶向基因组中的特定序列具有高度特异性并成为可能位点。特异性通过将蛋白质和核酸复合物插入分裂细胞来实现。该复合物包括与目标位点序列互补的RNA片段(称为单向导RNA)和与Cas9结合的支架序列，Cas9是一种在目标位点(基因)切割DNA，从而破坏基因的酶。在本研究中，Chiesa等使用该方法的改良版本，从第三方供者制备了基因表达发生改变的CAR-T细胞，这些CAR T细胞对肿瘤相关抗原有特异性，但不表达T细胞受体，因此无法介导同种异体移植物抗宿主效应。

他们是怎么做到的?

这种方法被称为碱基编辑，Chiesa等人使用了一种特殊类型的编辑，称为C-to-T碱基编辑。为了达到这种精确的编辑水平(在单个碱基的水平)，他们使用了一种具有新特性的Cas9蛋白的修改版本，其中之一是胞苷脱氨的能力。因此，修饰后的Cas9从胞苷的嘧啶环上去除一个胺基，从而将其转化为尿苷。尿苷甲基化为胸腺嘧啶，胸腺嘧啶与腺嘌呤配对。因此，胞苷脱氨酶引入一个胸腺嘧啶残基，取代胞苷，并改变序列。这种c - u -t转换可用于引入终止密码子以阻止转录或改变特异性信使RNA剪接位点以阻止蛋白质生成。经过修饰的Cas9的第二个特性是抑制尿嘧啶糖基化酶，从而阻止尿苷的修复。

实验主要方案与主要结果

利用碱基编辑技术制备了通用的现成嵌合抗原受体(CAR) T细胞。利用慢病毒转导健康志愿者供者的T细胞，使其表达对CD7 (CAR7，一种在T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)中表达的蛋白)有特异性的CAR (CAR7)。然后，研究者使用碱基编辑技术使编码CD52和CD7受体的3个基因以及αβ t细胞受体的β链失活，从而分别逃避淋巴细胞清除性血清疗法、CAR7 t细胞杀兄弟疗法和移植物抗宿主病。研究者在3例复发性白血病患儿中研究了这些经过编辑的细胞的安全性。这项1期研究的中期结果支持在复发性白血病患者中进一步研究碱基编辑T细胞，并表明免疫治疗相关并发症的预期风险。

如何预防同种异体CAR-T细胞的排斥反应？

在涉及给药同种异体造血细胞的其他情况下，受体对这些细胞的排斥反应可通过使用免疫抑制剂来控制。Chiesa等使用了一种免疫抑制化学免疫治疗方案，其中包括强效淋巴细胞杀伤抗体阿仑单抗(抗cd52)。然而，这产生了另一个问题:CAR T细胞通常表达CD52，因此易被阿仑珠单抗清除。因此，作者使用C-to-T基因编辑技术沉默了CAR T细胞来源的同种异体T细胞中的CD52，从而降低了这些细胞对免疫抑制方案的易感性。

CAR-T细胞的肿瘤靶点是什么

CAR-T细胞识别CD7, CD7是患者肿瘤T细胞白血病细胞上的细胞表面蛋白。通过慢病毒载体将识别单元(CAR)引入经异基因碱基编辑的T细胞。但CD7靶点带来了另一层复杂性，因为效应性CAR-T细胞本身表达CD7。人们不希望效应细胞相互杀伤，而不是杀伤肿瘤，因此Chiesa等人利用C-to-T碱基编辑方法沉默了同种异体T细胞中的CD7。

双链DNA断裂是危险的，不是吗?

是的，它们是，碱基编辑的一个相对优势是它会让染色体保持完整。当一个细胞暴露于多个双链DNA断裂时(就像同时进行三次编辑时的情况)，DNA修复机制会被激活以试图修复它们，这有时会导致染色体易位造成严重的遗传损伤，而染色体易位是通过两条“断裂”的染色体融合发生的。

是否有其他方法对效应细胞进行基因改造?

另外两种编辑碱基序列的实验性方法正在开发中。两者都使用引入DNA断裂的核酸酶:锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)。一项使用TALENS的临床研究因被认为与该干预相关的染色体易位而停止。

总结与未来展望

CAR-T细胞已经彻底改变了某些血液系统恶性肿瘤的治疗。然而，仍然存在一些障碍，本文对此进行了讨论。抗原选择对CAR-T细胞的功能至关重要。肿瘤细胞可通过CAR-T细胞的选择压力下调抗原表达。即使有适当的抗原靶向，也可能发生脱靶效应并引起相关毒性。在实体瘤中，让CAR-T细胞进入并浸润肿瘤是一个挑战。恶性肿瘤的免疫抑制微环境可加剧这一障碍。有效的治疗还存在CAR-T细胞相关毒性的风险，如CRS和神经毒性。然而，尽管存在挑战，新的策略和潜在的解决方案仍在不断发展，可能为未来更有效和更安全的治疗提供路径。

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