IL-2与IL-7/15产生NY-ESO-1特异性T细胞作用

TCR工程化T细胞在体内的抗肿瘤功效在很大程度上取决于分化程度较低的亚群，例如具有更大扩展性和长期持久性的幼稚样T细胞（TN）表型的T细胞。为了增加这些亚群，比较了补充IL-2或IL-7 / IL-15的纽约食管鳞状细胞癌-1（NY-ESO-1）特异性T细胞的生成情况。用MS3II-NY-ESO-1-siTCR逆转录病毒载体转导PBMCs。T细胞生成改编自CD19特异性CAR-T细胞生产方案。在IL-2或IL-7 / IL-15刺激下观察到T细胞的活力、扩增和转导效率的可比结果。IL-7 / IL-15导致CD4+ T细胞增多，CD8+ T细胞减少，使CD4+ T细胞中的T淋巴细胞数量增加，而CD8+ T细胞中的T淋巴细胞数量减少。在51Cr释放实验中，NY-ESO-1阳性SW982肉瘤细胞获得了类似的特异性裂解。然而，细胞内细胞因子染色显示IL-2刺激产生的T细胞中IFN-γ和TNF-α的产生显著增加。为了验证这些意外发现，在最初为TCR工程化TN细胞建立的另一个方案中评估了NY-ESO-1特异性T细胞的产生。IL-7/IL-15增加了TN的比例。但是，由于使用IL-7 / IL-15的T细胞的扩增速度明显减慢，TN的绝对数量没有增加。总之，IL-7 / IL-15在产生NY-ESO-1特异性T细胞方面似乎并不优于IL-2。这与CD19特异性CAR-T细胞中的观察结果形成鲜明对比。对于单个载体系统，应仔细评估细胞因子混合物的变化。

前言

使用TCR工程化T细胞与癌症特异性抗原结合的过继细胞疗法（ACT）正在成为一种潜在的癌症治疗策略。ACT与TCR工程T细胞的临床工作流程包括三个部分：自体免疫细胞的获得、T细胞的体外扩增和操作（包括TCR基因转移）、以及将T细胞重新输注给患者具有适当的肿瘤特异性抗原和HLA限制。

癌-睾丸抗原NY-ESO-1在多种肿瘤实体上表达，包括黑色素瘤，软组织肉瘤和多发性骨髓瘤。NY-ESO-1在缺乏MHC分子的成年生殖组织中的限制性表达为T细胞提供了一个合适的靶向，靶向毒性降低。使用NY-ESO-1特异性T细胞进行的临床试验表明，在多种癌症实体中，包括黑色素瘤、滑膜肉瘤和多发性骨髓瘤中，肿瘤有明显的消退。此外，将NY-ESO-1特异性T细胞与其他免疫治疗策略（包括疫苗和检查点抑制剂）相结合的多项试验正在进行中。

尽管在临床试验中有令人鼓舞的应答率，但治疗失败是常见的，大多数患者仅能实现短暂的肿瘤消退。NY-ESO-1表达的肿瘤内和肿瘤间异质性至少部分解释了这一观察结果。因此，TCR工程化T细胞优化正在解决几个方面的问题：去甲基化可以增加NY-ESO-1的表达，并可能增强免疫原性较差肿瘤中NY-ESO-1的作用。抑制内源性TCR表达可以防止TCR错配，从而提高肿瘤特异性TCR的表面表达，减少靶向毒性。TCRαβ亲和力的增强可改善靶识别，TCR基因与共刺激分子的偶联可增强T细胞的激活。

成功的细胞免疫治疗的另一个重要方面是细胞产物中T细胞亚群的组成。几项研究表明，与分化程度较高的效应T细胞相比，分化程度较低的T细胞（如幼稚样T细胞（TN）或干细胞记忆T细胞（TSCM）具有更大的扩增能力和更长的体内持久性，具有更好的抗肿瘤功效。用于T细胞生成的细胞因子混合物的组成对体外T细胞扩增和免疫表型有重要影响。在过去，IL-2的使用被确立为T细胞培养的金标准。最近，随着对体内T细胞稳态的更好理解，IL-7和IL-15已成为维持幼稚或记忆样T细胞表型的重要细胞因子。先前的一项研究表明，IL-7和IL-15而不是IL-2可以有效地富集TSCM。TCR工程化T细胞的最佳培养条件尚未确定。

在本文中，比较了使用两种不同的制造方案，在添加IL-2或IL-7/IL-15的培养基的情况下，NY-ESO-1特异性T细胞的产量。重点是确定不同细胞因子混合物对NY-ESO-1特异性T细胞的活力、扩增和T细胞亚群以及效应器功能的影响。

实验方法

两种方案的主要区别如图1所示：

图1 产生NY-ESO-1特异性T细胞的两种方法的培养条件和主要步骤。

对于这两个方案，在第7、10和14天进行培养基更换，并添加新的细胞因子。T细胞在6孔组织培养板中培养，并根据细胞总数转移到T25或T75组织培养瓶中。

结果

使用方案1，IL-2和IL-7/IL-15对活力、扩增和转导效率的影响

在用来自七个HDs的PBMC生成NY-ESO-1特异性T细胞的过程中，纵向评估T细胞的活力、扩增和转导效率。对于在添加IL-2或IL-7/IL-15的培养基中生成的NY-ESO-1特异性T细胞，观察到类似的活性（图2a）、扩增（图2b）和转导效率（图2c）。

使用方案2，IL-2和IL-7/IL-15对活力、扩增和转导效率的影响

在NY-ESO-1特异性T细胞与来自七个HDs的PBMC培养期间，纵向评估T细胞的活力、扩增和转导效率。在添加IL-2或IL-7/IL-15的培养基中培养的NY-ESO-1特异性T细胞的活力（图2d）相等，而基于IL-2的细胞扩增率明显较高（图2e）。此外，在有IL-2存在的情况下，与补充IL-7/IL-15的培养基相比，转导效率显著更高（图2f）。

图2 活力、扩增和转导效率。该图显示了方案1（a-c;n=7）和方案2 （d–f;n=7）的结果，其中 IL-2（黑线）或 IL-7/IL-15（灰线）。在T细胞培养的第7、10、14天评估活力（a，d）、细胞扩增（b，e）和转导效率（c，f）。

使用方案1不同的NY‑ESO‑1特异性T细胞亚群分布

补充的细胞因子对细胞产物中CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助性T（Th）细胞的分布有显著影响：在IL-2存在下培养产生的CD8+细胞毒性T细胞显著增多，而CD4+Th细胞显著减少（图3a）。

通过CCR7和CD45RA在TN（CD45RA+CCR7+）和中央记忆样T细胞（TCM：CD45RA−CCR7+）中的表达确定T细胞亚群CCR7+，效应器记忆样T细胞（TEM：CD45RA−CCR7−), 和末端分化的效应器样T细胞（TE：CD45RA+ CCR7−)。体外激活T细胞后，几乎所有T细胞都表达CD95。因此，分类为TN的T细胞可被视为TSCM样细胞。图3b显示了根据方案1在含有IL-2或IL-7/IL-15的培养基中产生的不同T细胞亚群的分布。IL-2在第7天、第10天和第14天介导了显著较高的TCM频率，在第10天和第14天介导了TEM频率。相反，IL-7/IL-15导致在第7天和第10天出现TE的频率显著升高，在第14天出现TN的频率显著升高。

使用方案2不同的NY‑ESO‑1特异性T细胞亚群分布

与方案1（图3a）相比，与基于IL-2的T细胞培养相比，使用方案2和IL-7/IL-15进行的细胞培养在第14天产生的CD8+细胞毒性T细胞显著增多，而CD4+Th细胞显著减少（图3c）。IL-2介导的TE在第10天和第14天的百分比显著升高，TEM在第10天和第14天的百分比显著升高，TCM在第10天的百分比显著升高。相反，IL-7/IL-15导致第10天和第14天TN的年龄百分比显著升高（图3d）。

图3 不同NY-ESO-1特异性T细胞亚群的分布。按照方案1和方案2（a、c），在T细胞培养的第7、10和14天评估CD3+/CD4+（实线）和CD3+/CD8+（虚线）NY-ESO-1特异性T细胞（n=7）的演变。NY-ESO-1特异性T细胞亚群由CCR7和CD45RA表达确定（n=7）。TN定义为CD45RA+CCR7+，TCM定义为CD45RA−CCR7+，TEM为CD45RA−CCR7−, TE为CD45RA+CCR7− T细胞。采用方案1和方案2比较IL-2和基于IL-7/IL-15的T细胞培养中TN、TCM、TEM和TE的比例差异（b，d）。

使用方案1的NY‑ESO‑1特定TN的相对分布和绝对数量

与IL-2相比，细胞因子混合对CD4+Th细胞和CD8+细胞毒性T细胞的分布有显著影响，IL-7/IL-15导致TN百分比显著增加（图4a）以及TN绝对数增加（图4b）在第10天和第14天的CD4+T细胞中。当T细胞在补充IL-7/IL-15的情况下培养时，第14天的CD8+TN百分比显著升高（图4c）。然而，与CD4+T细胞相比，基于IL-2和IL-7/IL-15的培养物中CD8+T细胞内TN的绝对数量没有差异（图4d）。

使用方案2的NY‑ESO‑1特定TN的相对分布和绝对数量

与IL-2相比，在T细胞培养的第10天和第14天，IL-7/IL-15显著增加了CD4+T细胞中TN的百分比（图4e）。然而，与IL-7/IL-15相比，使用IL-2的细胞产物中CD4+TN的绝对数量显著更高（图4f）。这主要是由于采用IL-2的方案2实现了更高的扩展率（图2e）。在这种情况下，CD8+TN与CD4+TN具有相似的特征。在CD8+T细胞中，IL-7/IL-15导致TN百分比显著升高（图4g），而CD8+TN的绝对数量较高（图4h）使用IL-2获得。

图4 TN的相对分布和绝对数量。比较含有CD3+/CD4+（%，a，e；绝对数量，b，f）和CD3+/CD8+（%，c，g；绝对数量，d，h）T细胞的IL-2（黑条）或IL-7/IL-15（灰条）的不同培养条件下NY-ESO-1特异性TN（n=7）的数量差异。

使用方案1的耗竭和归巢标记物

为了评估不同细胞因子诱导的衰竭状态和归巢标记，流式细胞术检测衰竭标记PD-1和TIM-3以及归巢标记CD62L和CXCR3的表达。在补充IL-2或IL-7/IL-15的情况下培养的NY-ESO-1特异性T细胞之间的PD-1表达（图5a）相似，而IL-2导致TIM-3在第7、10和14天的表达显著降低（图5b）。进一步评估PD-1和TIM-3的共同表达，并得出观察到双阳性细胞的分布，与使用的细胞因子混合物无关（图5c）。CD62L水平（图5d）未显示任何显著差异。相反，当IL-2添加到培养基中时，CXCR3水平在第10天和第14天显著升高（图5e）。

使用方案2的耗竭和归巢标记物

在第7天，补充IL-7/IL-15后，T细胞生产中PD-1的表达显著增加（图5f）。两种细胞因子混合物的TIM-3水平相似（图5g）。此外，在第7天，IL-7/IL-15导致PD-1/TIM-3共表达T细胞的百分比显著升高（图5h）。在使用IL-7/IL-15的第7、10和14天，CD62L水平显著降低（图5i）。当IL-7/IL-15添加到培养基中时，CXCR3水平在第10天和第14天显著升高（图5j）。

图5  NY-ESO-1特异性T细胞的耗竭和归巢标记。比较在添加IL-2（黑条）或IL-7/IL-15（灰条）的培养基中培养的NY-ESO-1特异性T细胞（n=7）的衰竭和归巢标记物的表达。在第7、10和14天评估衰竭标记PD-1（a、f）和TIM-3（b、g）、PD-1和TIM-3（c、h）的共同表达以及归巢标记ers CD62L（d、i）和CXCR3（e、j）的表达。

根据方案1生成的NY‑ESO‑1特异性T细胞的功能评估

在T细胞培养的第14天进行51Cr释放试验，并在第15天进行细胞内细胞因子染色。以HLA-A2阳性和NY-ESO-1阳性SW982细胞作为靶细胞。在51Cr释放试验中，在IL-2或IL-7/IL-15条件下产生的NY-ESO-1特异性T细胞之间的裂解活性在E:T比率为10:1至1:1时具有可比性（图6a）。NY-ESO-1特异性T细胞可选择性裂解NY-ESO-1阳性细胞，且不会显著裂解SYO-1（HLA-A2-阴性NY-ESO-1-阴性）、Fuji（HLA-A2-阳性NY-ESO-1-阴性）和MLS-1765-92细胞（HLA-A2-阴性NY-ESO-1-阳性）（补充图2a）。

对于IFN-γ和TNF-α的细胞内细胞因子染色，将T细胞与SW982细胞一起培养6小时。在所有CD3+T细胞以及CD4+Th细胞和CD8+细胞毒性T细胞中（图6b），在基于IL-2的产生下，细胞内IFN-γ水平显著升高。此外，IL-2在所有CD3+T细胞（图6c）以及CD4+T细胞（图6c）中的TNF-α水平显著升高。在CD8+T细胞中，在基于IL-2的产生下，仅观察到TNF-α水平升高的趋势，但未达到统计学意义（图6c）。此外，还评估了同时产生细胞因子TNF-α和IFN-γ的NY-ESO-1特异性T细胞的多功能性。通过IL-2刺激产生的NY-ESO-1特异性T细胞具有显著更高比例的多功能T细胞（图6d）。补充图2b、2c显示了与SYO-1细胞（HLA-A2阴性NY-ESO-1阴性）孵育6小时或无任何细胞刺激后的基线细胞因子产生。

补充图2  NY-ESO-1特异性T细胞对NY-ESO-1阳性靶细胞的特异性。

根据方案2生成的NY‑ESO‑1特异性T细胞的功能评估

在51Cr释放试验中，在IL-2条件下生成的NY-ESO-1特异性T细胞在高E:T比率下显示出更强的溶解活性，与在IL-7/IL-15存在下生成的T细胞相比，在5:1时达到显著水平（图6e）。

在细胞内细胞因子染色前的第15天，将NY-ESO-1特异性T细胞与SW982细胞一起培养6小时。补充IL-2或IL-7/IL-15的CD8+T细胞产生相似数量的IFN-γ（图6f），而补充IL-2的CD4+T细胞产生更高水平的IFN-γ（图6f）。IL-2刺激产生的所有CD3+、CD4+和CD8+T细胞（图6g）的TNF-α分泌均显著高于IL-2刺激产生的CD3+（图6g）。然而，无论使用何种细胞因子混合物，同时产生TNF-α和IFN-γ的多功能NY-ESO-1特异性CD3+T细胞的数量是相当的（图6h）。

图6  NY-ESO-1特异性T细胞的功能评估。NY-ESO-1特异性T细胞（n=3）的细胞毒性在与SW982靶细胞（HLA-A2阳性NY-ESO-1阳性）共培养12小时后通过51Cr释放试验进行评估。在不同效应物（NY-ESO-1特异性T细胞）与靶细胞（SW982细胞）的比率（10:1、5:1、2.5:1和1:1）下评估平均裂解。以未转导的T细胞和比例为5:1的SW982细胞作为对照。每个实验一式三份（a、e）。用SW982细胞刺激6小时后，测量细胞内IFN-γ和TNF-α的产生（方案1：n=4，方案2：n=7）。在CD3+、CD3+/CD4+和CD3+/CD8+细胞中测定总体IFN-γ（b，f）和TNF-α产生（c，g）以及同时产生TNF-α和IFN-γ（d，h）的多功能NY-ESO-1特异性T细胞。

根据方案1生成的CD19特异性CAR-T细胞

根据方案1，在IL-2或IL-7/IL-15存在下产生CD19特异性CAR-T细胞。使用来自5个HDs的PBMC。在T细胞产生的第10天和第14天确定CD19特异性CAR-T细胞的进化。活力（补充图3a）、转导效率（补充图3b）的对比结果在IL-2或IL-7/IL-15存在的情况下观察到CD19特异性CAR-T细胞的绝对数量（补充图3c）。含IL-2的T细胞培养有一种趋势，即CD8+细胞毒性T细胞比例较高，CD4+Th细胞较少，但在第14天没有达到显著水平（补充图3d）。第10天，IL-7/IL-15显著增加CD4+T细胞中TN的百分比（补充图3e）和第14天CD8+T细胞中TN的百分比（补充图3f）。然而，与IL-2相比，使用IL-7/IL-15的细胞培养仅显示出CD4+TN（补充图3g）或CD8+TN（补充图3h）绝对数更高的趋势。对于在IL-2或IL-7/IL-15存在下产生的T细胞的功能表征，将CD19特异性CAR-T细胞与CD19阳性Daudi细胞孵育6小时。对IFN-γ和TNF-α进行细胞内细胞因子染色。在CD4+（补充图3i）和CD8+（补充图3j）中检测到这些细胞因子的类似产生。使用IL-2或IL-7/IL-15产生的CD19特异性CAR-T细胞被检测到。

总结

ACT与TCR工程化T细胞构成了实体瘤和血液系统恶性肿瘤的一种有希望的治疗选择。除了优化载体设计外，T细胞的生产过程在ACT中也至关重要。生产过程中需要考虑的因素包括培养基类型、激活条件、激活的T细胞数量和转导的逆转录酶浓度、时间安排和细胞因子混合物。细胞因子混合物是肿瘤特异性T细胞制造的基本元素，对最终细胞产物产生重大影响，从而取得治疗成功。通过比较在两种不同的制造方案中分别使用IL-2或IL-7/IL-15的T细胞培养（图1），本研究旨在确定产生NY-ESO-1特异性T细胞的最佳细胞因子，提供足够的细胞扩增和长期体内T细胞持续存在的最佳表型。

使用两种评估的生产方案，在IL-2或IL-7/IL-15存在下培养的NY-ESO-1特异性T细胞的活性相似。使用方案1，观察到可比较的细胞扩增和转导效率。然而，当使用方案2时，当补充IL-2时，可以观察到显著更高的细胞扩增和更高的转导效率。与方案1（600 U/ml vs 100 U/ml）相比，方案2条件下的较高增殖可能归因于较高水平的IL-2，因为已知较高水平的IL-2可诱导T细胞增殖。由于细胞分裂是逆转录病毒整合的必要条件，较高的增殖率可能有助于提高转化效率。相反，在方案2的条件下使用IL-7/IL-15导致细胞增殖有限，并且不能产生足够的细胞用于细胞治疗。

按照方案1，与IL-2相比，IL-7/IL-15富集了CD4+T细胞，并减少了CD8+T细胞的数量。这与之前的研究和我们之前关于CD19特异性CAR-T细胞的报告一致。然而，当使用方案2时，基于IL-7/IL-15的T细胞生成显示CD8+T细胞富集，这是出乎意料的。据报道，基于逆转录连接蛋白的T细胞活化可在体外富集CD8+T细胞，而用于T细胞活化的抗CD28可额外增加CD4+T细胞，即使在基于逆转录连接蛋白的T细胞活化的情况下也是如此。因此，在IL-7/IL-15存在的培养条件下观察到的较高频率的CD4+T细胞和较低频率的CD8+T细胞，可通过使用方案2存在用于T细胞激活的逆转录连接蛋白和抗CD28来逆转。

T细胞培养的金标准生长因子IL-2受到常见γ链细胞因子如IL-7、IL-15、IL-21和非γ链细胞因子IL-12的挑战。越来越多的研究表明它们优于IL-2。IL-12与IL-7或IL-21一起产生CD62Lhigh CD28 High CD127 High CD27 High CCR7 High TCR工程CD8+T细胞，其在小鼠模型中的移植效果明显优于在IL-2存在下生长的细胞。IL-12在T细胞上保持高水平的CD62L，从而产生优异的抗肿瘤活性。IL-7和IL-15促进分化程度较低的细胞、CD27和CD28的体外表达，而暴露于IL-15和IL-21的T细胞在小鼠模型中表现出最长的持久性和最好的肿瘤清除能力。在之前的研究中，我们证明，在体外激活后，几乎所有T细胞都表达CD95。因此，在本研究中称之为低分化T细胞亚群的CCR7+CD45RA+TN亚群可被视为TSCM亚群。据报道，具有TSCM表型的CAR-T细胞具有更高的体内扩增能力和更长的持久性。通过在T细胞培养中添加IL-7/IL-15而不是IL-2，可以在体外富集TSCM。因此，本研究的主要目的是评估IL-7和IL-15的组合，以丰富这一分化程度较低的T细胞亚群。与两种方案一致，IL-7/IL-15增强了分化程度较低的NY-ESO-1特异性T细胞的子集。然而，应用方案1时TN的富集主要发生在CD4+T细胞中。添加IL-2产生的CD8+T细胞数量显著增加。因此，CD8+TN的类似绝对数为使用方案1时观察到。在补充IL-7/IL-15的CD19特异性CAR-T细胞生产中，未观察到他选择性富集CD4+TN。CD4+T细胞在TCR工程T细胞中的作用尚不明确。在功能分析中，我们还观察了CD4+NY-ESO-1特异性T细胞的细胞因子产生。CD4+T细胞可额外增强抗肿瘤活性。已经报道了NY-ESO-1特异性CD4+T细胞的特异性富集方案。然而，由于依赖于CD8+T细胞进行特异性靶识别的HLA I类分子表达NY-ESO-1抗原，CD8+NY-ESO-1特异性T细胞可能提供主要的抗肿瘤活性。在使用方案2的IL-7/IL-15存在的情况下，TN在CD4+和CD8+T细胞室中富集。IL-7/IL-15限制了T细胞的扩增。因此，与以IL-2为基础的生产中获得的细胞相比，TN的绝对数量更低。总的来说，TN富集的益处似乎不足以推荐IL-7/IL-15代替IL-2来生成NY-ESO-1特异性T细胞。

T细胞衰竭是限制抗肿瘤反应的主要因素。耗尽的T细胞增殖或释放细胞因子的能力有限，并且表达高水平的抑制性受体，如PD-1和TIM-3。PD-1是另外一种T细胞活化标记物，转导后表达逐渐减少。在方案1的条件下，用IL-2或IL-7/IL-15生成的NY-ESO-1特异性T细胞表达类似水平的PD-1，在方案2第7天补充IL-7/IL-15后，PD-1水平显著升高。PD-1的这种长期阳性可能至少在一定程度上是使用IL-7/IL-15减少T细胞扩增的原因。在方案1的条件下使用IL-7/IL-15时，TIM-3水平显著升高。相比之下，NY-ESO-1特异性T细胞在IL-2和基于IL-7/IL-15的第二代人中表达的TIM-3水平相当。T细胞衰竭通常不被定义为一个衰竭标记物的单独表达，而是多个标记物的联合阳性。先前的研究表明，患者和实体瘤或恶性血液病小鼠模型中的PD-1+/TIM3+T细胞功能紊乱，与不良预后相关。与单一阻断TIM-3/Gal-9或PD-1/PD-L1相比，联合阻断TIM-3/Gal-9和PD-1/PD-L1通路在更大程度上恢复了T细胞功能。在本文研究中，方案1后的IL-2和IL-7/IL-15细胞生产中的PD-1+/TIM-3+细胞数量相当，而方案2后的第7天，IL-7/IL-15诱导的PD-1+/TIM-3+T细胞数量较高。需要进一步评估PD-1和TIM-3表达对接受ACT患者临床结果的影响。

至于归巢标记物，ACT的临床前小鼠模型表明，CD8+T细胞表达CXCR3对于肿瘤控制和生存是必不可少的。另一项研究表明，CXCR3在介导CD8+T细胞浸润到肿瘤中从而导致抗肿瘤免疫中起着重要的、非冗余的、细胞自主的作用。此外，据报道，CD62L是初始稳态增殖期间T细胞归巢至淋巴结的关键成分。在我们遵循方案1的研究中，我们观察到IL-2和IL-7/IL-15为基础的T细胞培养物中CD62L的表达相似，而在第10天和第14天，IL-2存在时CXCR3的水平显著升高。另一方面，在应用方案2的IL-2存在的情况下，检测到显著更高的CD62L水平和更低的CXCR3表达。因此，使用方案1，在IL-2存在的情况下产生的NY-ESO-1特异性T细胞更有可能迁移到肿瘤组织中，并更有利于抗肿瘤反应。相反，按照方案2，在IL-2存在的情况下产生的NY-ESO-1特异性T细胞更有可能迁移到淋巴结。

在目前的研究中，NY-ESO-1特异性T细胞在IL-2和基于IL-7/IL-15的T细胞培养物中的溶解能力与方案1相似。这与我们之前对CD19特异性CAR-T细胞的研究结果形成了鲜明对比：与基于IL-7/IL-15的CAR-T细胞培养相比，在添加IL-2的培养基下生成的CAR-T细胞对肿瘤细胞的裂解率显著提高。然而，在我们应用方案2的研究中获得了与CD19特异性CAR-T细胞相似的结果：与在含有IL-7/IL-15的培养基中产生的细胞相比，来自IL-2的生产的NY-ESO-1特异性T细胞显示出明显更强的溶解活性。与采用方案2的IL-7/IL-15相比，通过IL-2刺激，TEM和TE细胞的富集程度更高，可能导致更高的裂解。使用方案1生成NY-ESO-1特异性T细胞时，这种效应不太明显。CD4+和CD8+T细胞内T细胞亚群的分布不能解释这种差异（补充图4）。另一方面，与基于IL-2的T细胞生产相比，在补充IL-7/IL-15的培养基中生成的GD2特异性CAR-T细胞在51Cr释放试验中具有更高的溶解能力。总体而言，载体构建可能对肿瘤特异性T细胞的肿瘤溶解产生重要影响。此外，用短时间的51Cr释放杀伤试验很难判断转基因T细胞的体内疗效。

补充图5 方案1和方案2补充IL-2或IL-7/IL-15的培养基中NY-ESO-1特异性T细胞培养的差异总结。在第10天、第14天和第15天，分别比较在添加IL-2 or IL-7/IL-15的培养基中培养的NY-ESO-1特异性T细胞。绿色表示每个特定因子的增加，红色表示每个特定因子的减少。灰色表明两种细胞因子混合物之间没有变化。

使用方案1，在IL-2存在的情况下产生的T细胞中，细胞因子的产生显著较高。这包括IFN-γ和TNF-α以及多功能T细胞产生两种细胞因子。应用方案2，IL-2介导较高水平的TNF-α。这些发现与我们目前和以前对CD19特异性CAR-T细胞的经验以及GD2特异性CAR-T细胞的数据形成了鲜明对比，在这些细胞中，观察到IL-2与IL-7/IL-15基CAR-T细胞生产之间的细胞因子分泌无相关差异。细胞因子产生能力较低的部分原因可能是在添加IL-7/IL-15的培养基中产生的所有T细胞中TN的比例较高。已知TN产生IFN-γ和TNF-α的能力较低。此外，IL-2导致“耗尽”T细胞表型减少，TIM-3和PD-1表达降低。与补充IL-7/IL-15的培养基中产生的T细胞相比，这可能提供了更高的产生细胞因子的能力。总的来说，当在添加IL-2或IL-7/IL-15的培养基中生成细胞因子时，TCR工程T细胞和CAR-T细胞之间的细胞因子生成似乎存在重大差异。

细胞疗法，尤其是转基因细胞疗法，成本非常高。因此，成本效益是T细胞生成的关键问题。对于IL-2，市场上有临床批准的产品（Proleukin®）。因此，出于体外目的，成本相对较低。相反，与IL-2相比，补充IL-7/IL-15的T细胞生成成本可能高出10-100倍。考虑到TN富集在产生NY-ESO-1特异性T细胞方面的益处相对较低，在这种情况下，很少有证据支持IL-7/IL-15胜过IL-2。

总之，在产生NY-ESO-1特异性T细胞方面，与基于IL-2的T细胞生产方案相比，IL-7/IL-15似乎并不优越。这与我们和其他人在CAR-T细胞制造方面的观察结果形成了鲜明对比。因此，应使用不同的载体系统仔细评估细胞因子混合物的变化，并针对个人目的进行优化。

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