Cell！人类自然杀伤细胞的泛癌单细胞全景图

导语：

自然杀伤（NK）细胞在对抗肿瘤进展的先天免疫反应中发挥着不可或缺的作用。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者描述了NK细胞在肿瘤微环境中的表型和功能多样性，对 来自24种癌症类型的患者的 NK 细胞进行了综合单细胞 RNA 测序分析。以肿瘤类型特异性的方式观察了 NK 细胞组成的异质性。文章发表在《Cell》上，影响因子为64.5，文章题目为：A pan-cancer single-cell panorama of human natural killer cells。

数据介绍

本研究所使用数据涵盖 24 种癌症类型，包括来自 716 名患者的肿瘤、邻近非肿瘤组织、外周血和淋巴结等其他组织的 1,223 个样本，以及 60 名健康对照（图 1A、1B）。

结果解析

01以单细胞分辨率构建人类泛癌NK细胞景观

为了公正地定义 NK 细胞的泛癌群体结构，本研究整合了数据集中批次效应最小的 scRNA-seq 数据，并进行了两轮无监督聚类。 第一轮分析涉及区分两种特征明确的主要细胞类型 CD56brightCD16lo 和 CD56dimCD16hi，基于典型细胞标记 NCAM1 和 FCGR3A 的高表达，这对应于之前报道的“NK_1”和“NK_2”群体。CD56brightCD16lo 区室可以进一步细分为 5 个子集，在第二轮聚类期间识别出 9 个 CD56dimCD16hi 子集（图 1C 和 1D）。本研究没有观察到跨癌症类型或不同子集的两个主要群体中 KLRF1 表达的显著差异。这些子集的特点是每个主要群体中不同特征基因的高表达。高表达 KLRC2 (NKG2C) 的 CD56dimCD16hi c8-KLRC2 NK 细胞被认为是适应性 NK 细胞。 接下来，本研究检查了所有子集的组织分布，观察到了不同的组织富集模式，这表明综合分析可以保留不同组织的异质性（图 1E、1F ）。为了进一步证实聚类的稳定性，来自血液、肿瘤和邻近非肿瘤组织的 NK 细胞分别重新聚类，结果高度一致。

图 1

本研究进一步检查了基因表达特征，以破译不同群体之间的功能差异（图 1G）。CD56dimCD16hi NK 细胞表现出细胞毒性效应基因的高表达，包括穿孔素 (PRF1) 和大多数颗粒酶（GZMB、GZMA 和 GZMH），但 GZMK 除外，GZMK 只在 CD56brightCD16lo NK 细胞中表达。 本研究还观察到 CD56brightCD16lo c2 和 c4 同时表达 IL18 及其受体 IL18R1，这意味着 IL-18 依赖性自分泌通路在这些亚群中具有潜在的关键作用。引人注目的是，CD56dimCD16hi NK 细胞亚群也可以表现出某些细胞因子的特异性表达，但具有与 CD56brightCD16lo 亚群不同的模式。特别是，CD56dim CD16hi 子集 c4-NFKBIA 在所有 NK 细胞子集中表现出相对较高的炎症评分，主要表达 CCL3、CCL4 和 CCL4L2，表明它们能够招募其他免疫细胞（例如 T 细胞）。 本研究的结果通过细胞类型特异性互补策略鉴定了参与 cDC1 招募的各种 NK 细胞亚群。CD56brightCD16lo c2和c4表达初级水平的XCL1和XCL2，而另一个cDC1趋化基因CCL5优先由CD56brightCD16lo（c1-GZMH和c3-CCL3）和CD56dimCD16hi（c1-IL-32和c8-KLRC2）NK细胞产生。此外，本研究描述了激活和抑制受体的概况，观察到 NK 细胞亚群之间的明显变化。与其他富含组织的 CD56dimCD16hi 亚群（c4-NFKBIA、c5-MKI67 和 c7-NR4A3）相比，c6-DNAJB1 NK 细胞表现出最高的应激评分和最弱的细胞毒性，表明它们的转录和功能表型显著不同（图1G ）。综上所述，本研究以单细胞分辨率提供了 NK 细胞的详细转录组谱。而且本研究不是将 NK 细胞作为单一群体进行分析，而是剖析 NK 细胞的子集特异性分子特性，揭示其未被充分认识的异质性。

02不同癌症类型NK细胞的组织异质性

接下来，本研究评估了不同癌症类型中肿瘤浸润 NK 细胞群的偏好，观察到明显的差异 （图 2A）。例如，未成熟的CD56brightCD16lo NK细胞在鼻咽癌和基底细胞癌中占主导地位，而成熟的CD56dimCD16hi NK细胞则占据肾癌和肺癌。其他癌症，如结直肠癌和 HCC，则没有表现出明显的倾向（图 2A）。对于包括肺癌和肾癌在内的癌症类型，尽管肿瘤和邻近非肿瘤组织之间主要NK细胞类型保留，但CD56dimCD16hi NK细胞的比例显著下降（图2B）。有趣的是，与邻近的非肿瘤组织相比，乳腺癌和食道癌中占主导地位的 NK 细胞群发生了逆转（图 2C）。这些观察结果表明，固有器官特性和恶性肿瘤相关因素对 NK 细胞群的形成具有复合影响。

图 2

本研究从子集角度进一步探讨了 NK 细胞的癌症类型特异性，并进行无监督聚类，以按 NK 细胞子集比例对分析的癌症类型进行分层。c2-CX3CR1 等 NK 细胞亚群在胰腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中表现出强烈的偏好，在某些亚型的癌症类型中观察到了高变异性。例如，c4-NFKBIA和c7-NR4A3显示从头颈鳞状细胞癌和甲状腺癌到食管癌和鼻咽癌的中位频率显著降低（图2D）。尽管观察到明显的差异，但包括子宫体子宫内膜癌、基底细胞癌和食道癌在内的癌症类型聚集在一起，所有癌症类型都具有丰富的 CD56brightCD16hi c5-CREM 和最少的 c4-IL-7R NK 细胞。特别值得注意的是，上述处于低成熟阶段的罕见 CD56brightCD16hi NK 细胞亚群在黑色素瘤和白血病中大量存在，尤其是在急性髓系白血病 (AML) 亚型中（图 2D）。NK 细胞的这种低成熟阶段与 AML 患者的总生存期和无复发生存率降低有关。与其他 NK 细胞群相比，这些 CD56brightCD16hi 细胞表现出独特的表型和功能转变，因为它们的极低激活和抑制受体评分（图2E）。目前基于 NK 细胞的疗法侧重于增强 NK 细胞的活化和寿命，但通常忽视癌症类型之间的异质性以及 TME 对 NK 细胞细胞毒性功能的抑制影响，这些在未来的治疗策略中应予以考虑。

03RGS1是组织浸润NK细胞的标志

如上所述，NK细胞成分从血液到组织都发生了显著变化。同样，在组织浸润的NK细胞和它们的血液对应细胞之间检测到广泛的转录变化(图3A和3B)。先前的研究已经确定了组织驻留NK细胞的几种标记物，如CD69、CD103、CXCR6和CD49a。然而本研究发现ITGA1 (CD49a)、ITGAE (CD103)和CXCR6在单细胞转录组水平的检测很少，CD69在NK细胞(包括血液细胞)中广泛表达(图3E)。据报道，这些标记物在特定组织的 NK 细胞群中优先表达。这些促使从泛癌的角度以公正的方式发现强大的 NK 细胞驻留标记物。

图 3

本研究选择了血液和组织之间差异表达的基因，并进一步评估了它们区分 NK 细胞组织来源的敏感性和特异性。因此，RGS1被明显识别，它只在肿瘤和邻近非肿瘤组织内的 NK 细胞中表达，但在血液中几乎检测不到（图 3C 和 3D）。此外，RGS1的表达与包括KLF2和SELL在内的迁移信号相反（图3E）。与上述传统的组织驻留标记相比，RGS1 显示出更高的敏感性和特异性。接下来本研究直接比较了RGS1与ITGAE和CD69及其组合在血液中的表达模式，观察到RGS1单独在血液中的检出率最低，而RGS1/CD69组合可以进一步提高组织中的阳性检出率（图 3F ）。此外，在区分血液和非血液 NK 细胞方面，RGS1/CD69 组合可以实现比单独使用任一组合更高的曲线下面积 (AUC) 值。而RGS1 在分析的患者和癌症类型中广泛表达（图 3G、3H ）。总之，这些特征意味着 RGS1 单独或其与 CD69 组合的潜在作用是在转录组水平上成为组织浸润 NK 细胞的优异标记。

04肿瘤相关NK细胞程序及其特征

使用 RNA 速度，本研究解码了 NK 细胞的转录动态，观察到 CD56brightCD16lo 和 CD56dimCD16hi NK 细胞中从富含血液的亚群到肿瘤浸润群体的清晰定向流动（图 4A ）。相应地，RGS1 的表达沿着速度流升高。本研究发现 CD56dimCD16hi c6-DNAJB1 NK 细胞位于速度末端，从而推断为终态（图 4A）。值得注意的是，来自邻近非肿瘤组织的 CD56dimCD16hi NK 细胞主要在富含 c7-NR4A3 细胞的均匀流形近似和投影 (UMAP) 区域观察到；相比之下，肿瘤来源的 CD56dimCD16hi NK 细胞在富含 c6-DNAJB1 细胞的 UMAP 区域中占主导地位（图 4B）。一致地，富含肿瘤的 c6DNAJB1 NK 细胞的标记物（例如 DNAJB1 和 HSPA1A）在肿瘤浸润的 CD56dimCD16hi NK 细胞群中高度表达（图 4C）。此外，本研究在c6-DNAJB1和c7-NR4A3 NK细胞中观察到线粒体基因的相似表达水平，表明c6-DNAJB1 NK细胞的应激表型与细胞质量无关。由于 c6-DNAJB1 细胞在肿瘤中特异性富集，因此本研究将这一群体称为肿瘤相关 NK (TaNK) 细胞。

多重免疫荧光染色进一步证实了癌症中 TaNK 细胞的存在 （图 4D）。本研究还使用流式细胞术在体内验证了 TaNK 细胞 (CD56dimCD16hi HSP40+ ) 的肿瘤富集。在 1 个肝内胆管癌和 6 个 HCC 样本中，鉴定出 TaNK 细胞，其在肿瘤浸润 CD56dimCD16hi NK 细胞中的比例高于匹配的邻近肝组织中的比例，与本研究的 scRNA-seq 数据一致（图 4E ）。

图 4

然后，本研究使用伪时间推断分析研究CD56dimCD16hi NK细胞的动态，发现TaNK细胞沿着CD56dimCD16hi NK细胞的推断伪时间越来越多地出现，并在末期富集，与RNA速度分析的结果一致。为了检查 TaNK 细胞的新特征，本研究将基因表达谱拟合到伪时间。有趣的是，CD56dimCD16hi NK 细胞在过渡过程中显示出细胞毒性降低以及抑制性受体和应激基因表达升高（图 4F）。值得注意的是，在所有肿瘤浸润 CD56dim CD16hi NK 细胞亚群中，末端 TaNK 细胞具有最低的细胞毒性和最高的应激评分。相比之下，邻近非肿瘤组织中富集的相应 c7NR4A3 具有高度细胞毒性（图 4G）。通过对几种癌症类型进行多重免疫荧光染色，本研究观察到 TaNK 细胞表现出较低水平的 GZMB（图 4H）。通过对肝癌患者的流式细胞术分析进一步证实，与CD56dimCD16hi HSP40 NK细胞相比，TaNK细胞在肿瘤部位的细胞毒性颗粒(颗粒酶B和穿孔素)表达较低，抑制受体CD158a (KIR2DL1)和CD158e (KIR3DL1)表达较高(图4I和4J)。这些结果表明 TaNK 细胞可能与功能障碍状态有关。此外，本研究还观察到 NR4A 核受体家族随着伪时间增加的差异动态趋势（图 4F）。c7-NR4A3 NK 细胞高水平表达 NR4A2 和 NR4A3，而 TaNK 细胞高水平表达 NR4A1。有趣的是，NR4A1 已被确定为 T 细胞功能障碍的关键介质 ，并被认为有助于限制实体瘤中 CAR-T 细胞的功能。 总之，本研究的数据表明肿瘤中的 TaNK 细胞可能会出现终末功能障碍，并可能在TME中发挥关键作用。

05TaNK细胞与不良预后和免疫治疗耐药性的关系

由于 NK 细胞和 CD8+ T 细胞表现出广泛的表型和功能相似性，本研究接下来检查了针对 CD8+ T 细胞的免疫检查点阻断 (ICB) 疗法是否也会影响 NK 细胞。 在肿瘤浸润 NK 细胞和 CD8+ T 细胞中，TaNK 细胞和耗竭的 T 细胞 (Tex) 表现出显著的应激状态（图 5A），表明它们参与了肿瘤免疫反应。两者均高度表达一系列抑制性受体分子；然而，它们对各种免疫调节基因具有不同的表达谱。传统的免疫检查点基因，如 PDCD1 和 CTLA4，在 TaNK 细胞上几乎不表达（图 5A），这意味着它们不是抗 PD-1/CTLA-4 疗法的直接靶标。因此，TaNK 细胞在 TME 和当前的 ICB 治疗中可能发挥与 Tex 细胞不同的作用。

图 5

本研究观察到不同癌症类型的 TaNK 细胞丰度存在显著差异（图 5B），并且肿瘤分期对 TaNK 细胞的比例产生边际影响（图 5C）。值得注意的是，在癌症基因组图谱 (TCGA) 数据集中，肿瘤中的高 TaNK 细胞信号与大多数癌症类型的较差生存率相关（图 5D 和 5E）。本研究进一步应用基于深度学习的模型来进行反卷积和细胞组成分析，发现TaNK细胞频率高表明癌症患者的预后不良。本研究还通过分析之前乳腺癌和黑色素瘤 ICB 治疗研究中预处理肿瘤的 scRNA-seq 数据来检查 TaNK 细胞是否与 ICB 治疗反应相关（图 5F）。对于两种癌症类型，在无反应患者中观察到的 TaNK 细胞比例高于有反应患者。进一步利用已发表的多种癌症（包括黑色素瘤、 肺癌、和转移性尿路上皮癌）的大量数据，本研究验证了无反应患者比有反应患者表现出更强的 TaNK 细胞信号（图 5G）。

本研究推测，长期浸润可能会赋予肿瘤中TaNK细胞的功能状态，导致其无法有效杀死恶性细胞。TaNK 细胞的富集与针对肿瘤的免疫反应受损以及对当前 ICB 疗法的敏感性降低有关。研究结果揭示了TaNK细胞在肿瘤中的潜在作用，并为合理设计基于NK细胞的免疫疗法提供了参考。

06TME中塑造肿瘤浸润NK细胞功能的潜在介质

为了深入了解 TME 中 NK 细胞的调节程序，本研究利用 CellPhoneDB 来探测 NK 与其他 CD45+ 免疫细胞（包括 T 细胞和骨髓细胞）之间潜在的细胞间相互作用。与 T 细胞相比，除肥大细胞外的大多数骨髓细胞类型与 CD56dimCD16hi NK 亚群表现出强烈的潜在相互作用（图 6A）。特别令人感兴趣的是，TaNK 细胞预计可通过 ANXA1 调节多种骨髓细胞类型，ANXA1 是一种与炎症反应期间免疫抑制和诱导巨噬细胞重编程相关的蛋白质 （图 6B）。这意味着功能失调的 NK 细胞可能有抑制 TME 中促炎巨噬细胞的潜力。为了进一步阐明 NK 细胞衍生的 ANXA1 在巨噬细胞中的作用，本研究对肺癌和肝癌的肿瘤样本进行了多重免疫荧光染色，并鉴定了 ANXA1+ NK 细胞群。与远离 ANXA1+ NK 细胞的巨噬细胞相比，靠近 ANXA1+ NK 细胞的巨噬细胞表现出较低的激活标记 CD86 表达水平（图 6C、6D）和较高的抗炎标记转化生长因子 b (TGF-b) （图6E、6F）。

图 6

值得注意的是，在树突细胞 (DC) 亚群中，LAMP3+ DC、最近表征的成熟 cDC（也称为 mregDC）显示出与 CD56dimCD16hi NK 细胞最强的相互作用潜力（图 6A）。多重免疫荧光分析显示 ，LAMP3+ DC 与 NK 细胞共定位（图 6J ）。预计它们之间的相互作用是通过 IL-15-IL-15 受体和 NECTIN2-TIGIT 相互作用轴介导的（图 6B）。重要的是，在转录组水平上，LAMP3+ DC 在免疫群体中表达最高水平的 IL15、PVRL2 (NECTIN2) 和 PVR（图 6G ）。流式细胞术也证明了 LAMP3+ DC 中 IL-15 的高表达（图 6H）。IL-15 已被确定为一种与体内平衡相关的细胞因子，可维持 NK 细胞的长寿，并用于 NK 细胞输注和体外增殖。  相比之下，TIGIT 作为抑制性受体有助于抑制 NK 细胞介导的免疫反应。此外，在 TCGA 数据集中，LAMP3+ DC 的丰度与 CD56dimCD16hi NK 细胞相关（图 6I）。接下来研究了肿瘤中LAMP3+ DC的具体调控过程，发现肿瘤浸润的LAMP3+ DC与邻近非肿瘤组织相比，IL15的表达较低，表明LAMP3+ DC可能对肿瘤细胞的激活作用受损。TME 中的 CD56dimCD16hi NK 细胞。事实上，与 LAMP3+ DC 物理接近的 NK 细胞以较低水平表达颗粒酶 B（图 6J、6K ）。总之，分析表明 TME 中 LAMP3+ DC 对 CD56dimCD16hi NK 细胞的异常调节。

小编总结

为了描述NK细胞在肿瘤微环境中的表型和功能多样性，本研究对 716 名癌症患者的 NK 细胞进行了综合单细胞 RNA 测序分析，涵盖 24 种癌症类型。本研究以肿瘤类型特异性的方式观察了 NK 细胞组成的异质性。值得注意的是，本研究已经鉴定出一组肿瘤相关 NK 细胞，它们在肿瘤中富集，表现出抗肿瘤功能受损，并且与不良预后和免疫治疗耐药性相关。特定的骨髓细胞亚群，特别是 LAMP3+ 树突状细胞，似乎介导 NK 细胞抗肿瘤免疫的调节。本研究提供了对基于 NK 细胞的癌症免疫的见解，并强调了 NK 细胞亚群作为治疗靶点的潜在临床用途。