科研丨华西医院: Prevotella copri通过减轻肌肉质量损失和功能衰退来缓解肌少症(国人佳作)

编译：微科盟溧阳

编辑：微科盟居居、江舜尧。

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导读   

肠道菌群和粪便代谢物已被发现对肌少症有影响，但是否存在可缓解肌少症的细菌还缺乏研究，其分子机制尚不清楚。从中国西部地区开展的多民族观察性研究中选择受试者，探讨肠道微生物组、粪便代谢物与肌少症之间的关系。根据2014年亚洲肌少症工作组的标准诊断肌少症。肠道微生物组通过宏基因组测序进行分析，非靶向代谢组学用于分析粪便代谢物的差异。研究了健康个体和肌少症患者之间相对丰度差异最大的细菌，以及与细菌相关的代谢物的差异，以验证其在小鼠模型中对肌肉质量和功能的影响。该研究包括283名参与者(68.90%为女性，平均年龄66.66岁)，来自汉族(98人)、藏族(88人)和羌族(97人)。在三个民族肌少症和非肌少症受试者之间，Prevotella copri丰度整体下降(15.03% vs. 20.77%, P=0.01)。差异菌的功能表征显示，非肌少症组的支链氨基酸(BCAA)代谢富集(优势比为15.97，P=0.0068)。共有13种支链氨基酸及其衍生物在肌少症组中相对含量较低。体内实验发现灌胃活P .copri(LPC)的小鼠血液中BCAA水平更高(P<0.001)。LPC小鼠的悬挂时间(P<0.02)、转子上停留时间(P=0.0001)和握力(P<0.0001)均显著增加，表明肌肉功能较好。LPC小鼠腓肠肌和股直肌重量(P<0.05)较高。微计算机断层扫描显示LPC小鼠的腿部面积更大(P=0.0031)，小动物分析仪显示LPC小鼠的瘦体重比更高(P=0.0157)，表明肌肉量更高。综上所述，肌少症患者体内P. copri和BCAA水平均较低。在体内实验中，LPC灌胃能减轻肌肉质量和功能下降，提示可能缓解肌少症。这表明P. copri可能在肌少症的治疗中发挥潜在的治疗作用。    

论文ID

原名：Prevotella copri alleviates sarcopenia via attenuating muscle mass loss and function decline

译名：Prevotella copri通过减轻肌肉质量损失和功能衰退来缓解肌少症

期刊：Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle

IF：8.9

发表时间：2023.8

通讯作者：董碧蓉，于浩澎

通讯作者单位：四川大学华西医院；四川大学华西生物医学大数据中心

DOI号：10.1002/jcsm.13313

实验设计

结果

1.参与者特征 

为了研究肠道微生物组、粪便代谢物与肌少症之间的关系，我们从WCHAT老年队列中随机选择了283名参与者。在民族方面，汉族98人，藏族88人，羌族97人。WCHAT队列包括7536名参与者，涵盖了分布在中国西部的三个民族(汉族、羌族和藏族)。肌少症是根据亚洲肌少症工作组2014年的标准定义的。

所有受试者平均年龄为66.66岁，女性占68.90%。与非肌少症受试者相比，肌少症患者的年龄偏大(69.10±8.00 vs. 64.10±9.20岁)，体重指数偏低(22.50±2.70 vs. 26.20±3.40 kg/m2)，日常独立活动生活量表(13.00 ± 1.90 vs. 13.60 ± 1.10分)和社会支持评定量表(SSRS)的评分偏低。肌少症组白蛋白水平也显著降低(44.00±2.90 vs. 44.80±2.70 g/L)。最后，与肌少症的肌肉量和功能下降一致，肌少症组的握力(17.50±6.50 vs. 18.70±5.10kg)和骨骼肌质量指数值(SMI)(5.60±0.70 vs. 6.0±0.80 kg/m2)显著降低(图1A)。

表1 比较患有和未患肌少症受试者的人口统计学特征、人体测量、生活方式、慢性疾病。

图1 民族和肠道微生物组。

(A)研究抽样和参与者流程图；(B)汉族、羌族和藏族肠道菌群Shannon指数；(C)基于Bray-Curtis距离的无约束PCoA(主坐标Pco1和Pco2)表明，藏族与汉族和羌族的肠道微生物组在第一轴和第二轴上分离；在个体水平(D)和平均水平(E)上，民族间肠道微生物组的属水平分类分布。*P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001；Wilcoxon秩和检验。

2.汉族、羌族和藏族的肠道微生物组成 

多变量置换分析发现民族对肠道微生物有显著影响(F=3.88，P=0.01)。在WCHAT队列中，我们发现肌少症在3个民族中普遍存在，因此，我们首先研究了三个不同民族的微生物群落结构。分析表明，与汉族和羌族相比，藏族群体具有独特的微生物组成。藏族α-多样性较高(图1B)，在PCoA图上，藏族与其他两个民族存在明显的分离，其中PCo1和PCo2轴的差异均有显著差异(图1C)，表明藏族的群落结构更为明显。 在具体的分类方面，观察到一些共同的特征。其中普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌属(Bacteroides)、Roseburia、双歧杆菌(Bifidobacterium)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、Faecalibacterium、Eubacterium、Alistipes和Blautia是三个族群的主要细菌属。Prevotella和Bacteroidess是所有三个民族的微生物组中最丰富的两个属(图1D,E)。

LefSe分析发现了三个民族间存在差异的肠道细菌。与汉族和羌族相比，藏族组中Prevotella sp. CAG:5226、Firmicutes bacterium CAG:170、Roseburia sp. CAG:309、Lactococcus raffinolactis、Bacteroides sp. CAG:530、Ruminococcus sp. CAG:563、Firmicutes bacterium CAG:238和Enterococcus durans丰度较高，与汉族和藏族相比，羌族组中Alistipes finegold、Anaerostipes hadrus、Eggerthella lenta、Phascolarctobacterium faecium、Firmicutesbacterium CAG:145和Anaerotruncus colihominis显示出较高丰度。此外，与羌族和藏族相比，汉族个体具有更高水平的Firmicutes bacterium CAG:95(图2A,B)。总之，这些结果表明了汉族、藏族和羌族人群肠道微生物组的共同菌群和独特菌群。

图2 三个民族肠道微生物组的差异。

(A) 3个民族肠道微生物组差异丰富类群的LDA评分(LDA评分> 2且显著性< 0.05)；(B)由LEfSe分析生成的进化分枝图，代表了三个族群中肠道微生物组富集的分类群；中心点代表树的根(细菌)，每个环代表下一个较低的分类水平(门到种)。  

3.三个民族的肌少症患者中Prevotella丰度较低 

由于肠道微生物可能因民族而异，我们想找到一种与三个民族的肌少症患者有关的细菌。为了研究肌少症患者和健康个体肠道微生物的差异，我们比较了受试者的生理参数并鉴定了不同的分类群。在整个肠道微生物群落的生态水平上，肌少症患者和健康个体之间没有差异。样本内物种丰富度分析显示，各组间α-多样性和β-多样性没有显著差异。 

为了进一步探索肠道微生物组成的差异，使用Humann3对相对丰度进行了量化，结果显示，在门水平上，三个民族中拟杆菌门(47.7%)、厚壁菌门(39.8%)、放线菌门(8.5%)和变形菌门(3.4%)的丰度最高(图3A)。在属水平上，Prevotella、Bacteriides、Roseburia和Bifidobacterium丰度较高(图3B)。有趣的是，本研究发现肌少症患者和健康个体的菌群组成不同。LEfSe分析在每组中鉴定出几种差异细菌。在属/种水平上，肌少症患者Bacteroides vulgatus、Bifidobacterium、Roseburia和Faecalibacterium prausnitzii的相对丰度较高。另一方面，在健康人群中，Eubacterium retale(LDA=3.71，p=0.04)和P. copri(LDA=4.42，P=0.01)丰度较高(图3C)。进化分枝图显示，P. copri及其更高水平分类群在健康个体中更为丰富(图3D)。考虑到LEfSe的局限性，并为了鉴定出更可靠的可能被用来产生有益效果的菌群，我们使用双尾未配对Mann-Whitney U检验来确定E. retale和P. copri的相对丰度在肌少症患者和健康个体之间是否存在显著差异。结果观察到，与健康组相比，肌少症组中P. copri的相对丰度显著降低(20.77% vs. 15.03%，P=0.01)(图3E)。 由于年龄和性别是影响肠道微生物组成的已知因素，民族也会影响肠道微生物组成，因此进行了多变量关联分析。在调整了年龄、性别、民族等因素后，肌少症患者的Prevotella丰度仍显著低于健康人群(β=-8.81，P=0.004)。P. copri的变化趋势不同，但不显著；缺乏统计学差异(β=-5.44，P=0.058)可能是由于样本量有限。

然后，种族调查了两组之间对生物学功能的潜在贡献。对鉴定的差异基因进行了KEGG注释和富集分析，结果显示，多种氨基酸的生物合成和代谢途径富集，包括BCAAs的生物合成、氨基酸代谢、其他氨基酸的代谢(图3F，表S5)。综上所述，本研究证明了Prevotella、P. copri和产生BCAA的潜力在三个民族的肌少症患者中较低。

图3 与肌少症患者相比，健康人体内Prevotella copri的相对丰度更高。

(A, B)健康老年人和肌少症患者肠道微生物组的门水平(A)和属水平(B)分类学分布；(C)健康个体与肌少症患者肠道微生物组差异丰富类群的LDA评分(LDA评分>2且显著性< 0.05)；(D)由LEfSe分析生成的进化分枝图，代表了健康人群和肌少症患者中富集的肠道微生物类群。中心点代表树的根(细菌)，每个环代表下一个较低的分类水平(门到属)；(E)箱线图显示P. copri的相对丰度；(F)功能富集(KEGG)分析显示，健康老年人与SAR患者之间的差异基因在缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成和脂肪酸降解途径中富集。*P<0.05，**P<0.01；Wilcoxon秩和检验。  

4.肌少症患者的粪便支链氨基酸代谢物水平较低 

肠道菌群产生的代谢物影响宿主的健康和疾病。由于不同肠道微生物的功能与BCAA合成和代谢有关，作者通过代谢组分析研究了BCAA与肌少症的相关性。通过超高效液相色谱法研究了粪便代谢物的变化。为了全面寻找差异代谢物，使用正离子和负离子扫描模式评估了141名肌少症患者和142名健康个体的粪便样本中的代谢物。总共鉴定出1663种代谢物，然后使用人类代谢组数据库(Human Metabolome Database)将其划分为分子类。为了保证仪器的稳定性和样品的良好再现性，进行了PCoA分析。结果显示，经质控后的粪便代谢物在正离子和负离子模式下聚集，具有良好的再现性，表明测试系统稳定(图4A,B)。采用PLS-DA和正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)评估肠道微生物群的代谢模式。 

本研究发现，1663种代谢物中有216种(12.99%)在肌少症组与健康组之间存在显著差异。其中，肌少症组有19种代谢物水平显著升高，197种代谢物水平显著降低(图4C)。脂质和类脂分子以及有机酸及其衍生物是肌少症患者减少的两种主要代谢物类别(图4D)。此外，在肌少症组中观察到几种支链氨基酸及其代谢物水平的特异性降低，包括异亮氨酰-异亮氨酸、异亮氨酰-脯氨酸、缬氨酰-缬氨酸、γ-谷氨酰缬氨酸、γ-谷氨酰异亮氨酸和丝氨酰-缬氨酸(图4E)。

综上所述，与BCAA生物合成相关的途径在差异微生物群中富集，而肌少症患者的BCAA水平较低，可能与肠道微生物组有关。

图4 支链氨基酸在健康人体内富集。

(A, B) PCoA分析显示仪器稳定性良好，样品在正离子模式(A)和负离子模式(B)下重现性好；(C)火山图显示健康老年人和SAR患者肠道代谢物的差异(VIP > 1；CV < 0.3；比值> 1.5或<1/1.5；Wilcox BH P < 0.05)；(D)热图显示了两个主要类别中的差异调节代谢物。(LD:脂质和类脂分子；OD:有机酸及其衍生物)。(E)箱线图显示了差异调节的支链氨基酸及其衍生物。  

5.活Prevotella copri灌胃小鼠的血液中支链氨基酸水平较高 

由于P. copri在肌少症患者和健康个体之间的丰度差异最大，并且健康个体BCAA生物合成相关的途径富集(图3F)，BCAA水平较高(图4E)，我们猜测P. copri是否可以提高BCAA水平，从而缓解肌少症的症状。通过小鼠模型来检验P. copri对肠道和宿主肌肉的质量和功能的影响。

给20月龄小鼠灌胃LPC、热灭活P. copri、BCAA和生理盐水8周(图5A)。为了证实LPC灌胃成功，使用qPCR对小鼠粪便样本进行检测。结果显示，在活菌组中，P. copri的绝对丰度显著增加(图5B)，表明P. copri在小鼠肠道内成功定植。然后，我们定量测定血浆中BCAA的浓度，发现LPC和BCAA灌胃小鼠的BCAA水平高于PBS灌胃小鼠(图5C)。这些结果表明，增加肠道中P. copri的丰度可能会提高循环BCAA水平。

图5 灌胃活P. copri的老年小鼠BCAA水平较高。

(A)小鼠实验示意图。C57BL/6小鼠灌胃活P. copri (LPC) 5 × 108CFU/0.1 mL PBS，每周3次，连续8周；以无菌PBS灌胃或等量灭活P. copri (DPC)作为对照，灌胃浓度为1250 mg/kg的BCAA；(B)灌胃实验后小鼠粪便中P. copri的DNA绝对丰度；(C)灌胃实验后小鼠血液支链氨基酸(BCAA)浓度水平。*P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001；单因素方差分析。

6.Prevotella copri减轻了老年小鼠肌肉功能的下降 

由于血液BCAA水平与肌肉功能密切相关，我们想知道P. copri对老年小鼠肌肉功能有何影响。为了确保基线肌肉量和功能的一致性，我们检测了体重、钢丝悬挂时间、杆转数、杆下落速度、转子停留时间、网格悬挂时间、前肢握力和四肢握力的基线数据，没有观察到显著差异。 灌胃干预后发现，LPC灌胃组小鼠悬挂时间明显延长(P=0.0018)，在转子上停留时间明显延长(P=0.0001)，网格悬挂时间明显延长(P=0.0169)，前肢握力明显增大(P<0.0001)，四肢握力明显增大(P<0.0001)，表明LPC灌胃减轻了肌肉功能下降(图6A-F)。

此外，我们还进行了Sirius Red染色，它可以反映肌肉中胶原纤维的染色情况。结果观察到，LPC给药组比目鱼肌(图5b)和股直肌Collagen I(红色)和Collagen III(绿色)含量显著增加。这些结果表明，LPC改善肌肉活动效率，改善肌肉收缩和耐力。上述结果表明，小鼠灌胃LPC可减轻肌肉功能下降，可能延缓肌少症的发生。

图6 灌胃活P. copri可改善老年小鼠的肌肉功能

(A)四组间体重无差异；(B)与对照组相比，LPC组和BCAA组悬挂时间更长；(C)与对照组相比，LPC组和BCAA组在转子上停留的时间更长；(D)与对照组相比，LPC组和BCAA组的网格悬挂时间更长；(E, F)与对照组相比，LPC组和BCAA组的前肢握力和四肢握力更强。*P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001；单因素方差分析。  

7.Prevotella copri减轻了老年小鼠的肌肉质量损失 

为了探讨LPC对小鼠肌肉功能改善的因素，我们进一步评估了小鼠的肌肉量。我们进行了身体成分测试和微计算机断层扫描。结果显示，LPC灌胃组的瘦肌质量百分比(P=0.0157)和腿部面积(P=0.0031)较高(图7C，D)。而脂肪质量百分比在四组之间没有差异。此外，发现股直肌(P=0.0168)和腓肠肌(P=0.0335)的重量均大于对照组(图7A,B)。所有结果表明，LPC处理减轻了老年小鼠的肌肉质量损失。 为了研究LPC治疗减轻老年小鼠肌肉质量损失的潜在机制，我们检测了骨骼肌中肌肉蛋白合成和降解基因的表达。Atrogin和MURF 1都是骨骼肌中泛素介导的蛋白降解的重要调节因子，它们是肌肉损失和失用性肌萎缩的关键标志。为了确定LPC对蛋白质降解的影响，使用qPCR定量分析了这些蛋白质降解基因的表达。结果显示，LPC灌胃小鼠骨骼肌组织中MURF-1的表达较低(P=0.0104)，而Atrogin表达没有显著降低(P=0.0603；图7E，F)。与之相对应，我们还研究了肌肉蛋白合成基因MCK、MHC-1、MHC-2B的表达情况，但四组之间没有显著差异。

综上所述，LPC干预显著减轻了肌肉功能和质量下降，表明P. copri可能在缓解肌少症方面发挥潜在的治疗作用。

图7 灌胃活P. copri的老年小鼠肌肉质量更大。

(A)解剖后LPC组和BCAA组腓肠肌重量较高；(B)解剖后LPC组和BCAA组小鼠股直肌重量较高；(C)小动物体成分分析仪检测LPC和BCAA组的瘦体重比较高；(D)微计算机断层扫描测量的LPC和BCAA组小鼠腿部最大肌肉面积更大；(E)与对照组相比，BCAA灌胃组Atrogin mRNA的相对表达量较低；(F)与对照组相比，活P. copri灌胃组MURF1 mRNA相对表达量较低。*P<0.05，**P<0.01，***P＜0.001。  

讨论

本研究在一项多民族横断面研究中采用综合多组学框架证明并验证了与肌少症相关的人类肠道微生物组和代谢组的变化。观察到肌少症患者和非肌少症群体之间的微生物组组成存在许多差异。具体来说，Bifidobacterium的丰度在肌少症组中较高，而Prevotella的丰度在健康个体中较高。此外，肌少症组的BCAA水平也有所降低。LPC灌胃对减轻小鼠肌肉损失和增强肌肉功能有积极作用。这些发现表明微生物群与肌少症之间存在关联，靶向肠道微生物组可能是治疗肌少症的有效方法。 

越来越多的证据表明肠道微生物群和肌少症之间存在关系。最近发表的一篇论文显示，在欧洲(男性和女性)的大型独立队列中，27名患有肌少症的老年人和33名未患肌少症的老年人中，Prevotella和P. copri的丰度显著降低(P=0.021，0.018)。这些结果与我们的研究结果一致，即Prevotella和P. copri在健康个体中的丰度更高。然而，一些研究发现了不同的结果。例如，湘雅医院的一项研究纳入了1417名肌少症患病率为10%的参与者，他们发现肌少症患者的Desulfovibrio piger、Clostridium symbiosum、Hungatella effluvii、Bacteroides fluxus、Absiella innocuum、Coprobacter secundus和Clostridium citroniae相对丰度高于健康个体。此外，北京协和医院的研究人员观察到肌少症患者的微生物多样性总体减少。来自意大利的BIOSPHERE研究发现，在虚弱的老年患者中，Eubacterium的丰度减少，而Bifidobacterium丰度增加。此外，另一项研究发现，与健康个体相比，肌少症患者体内Bifidobacterium longum的水平较高，尽管差异无统计学意义。 

此外，一些研究还在小鼠模型中探讨了肠-肌轴的作用机制。在一项针对老年小鼠的研究中，研究人员发现，Sutterella与Barneseilla比例的改变与骨骼肌功能有关。此外，研究发现补充Lactobacillus casei Shirota可以减轻SAMP8小鼠的年龄相关性肌少症，而Bindels等人报道，口服补充Lactobacillus可以减轻急性白血病小鼠模型中肌少症的症状。而根据最近一项关于肠道微生物群和肌少症的荟萃分析，与无菌小鼠相比，脆弱拟杆菌无菌小鼠表现出更高的肌肉功能和肌肉质量。此外，乳杆菌和双歧杆菌菌株恢复了与年龄相关的肌肉损失。其他研究报道了7种益生菌补充剂Saccharomyces boulardii (SB)、Lactobacillus casei LC122 (LC122)、Bifidobacterium longum BL986 (BL986)、Lactobacillus paracasei PS23 (LPPS23)、Lactobacillus salivarius SA-03 (SA-03)、Lactobacillus plantarum TWK10 (LP10)和Bifidobacterium longum OLP-01 (OLP-01)对动物模型肌肉生长和功能的促进作用。为了清楚地研究肠道微生物组对肌少症的影响，还需要更多的研究来阐明动物模型中肠-肌轴调节的机制。 

本研究发现，肌少症组中P. copri丰度明显减少，但由于培养困难和其非致病性，对其详细的了解相对有限。它在非西方人群中是一种常见的人类肠道细菌，其在健康和疾病中的作用仍然存在争议。Fielding等人使用短时间体能测试，每隔一个月对不同体能老年人的肠道微生物群进行两次测试，发现活跃度高的老年人肠道微生物群中的Prevotella增加。将两组老年患者的肠道微生物群移植到小鼠体内后发现，在移植了高活动组粪便的小鼠肠道中，Prevotellaceae和Prevotella的丰度增加，握力增加了6.4%。然而，一些研究发现，在体弱老年人的粪便中也发现了Prevotella的显著减少。这些相互矛盾的结果可能是由于具有不同基因的P. copri菌株之间差异较大。此外，人类肠道P. copri菌株的不同遗传和功能特征与不同的习惯饮食有关。 

动物研究发现，摄入益生元可以增加肥胖小鼠肠道中Prevotellaceae和Prevotella的丰度，同时增加肌肉质量，减少脂肪量。Chen等人观察到，在配方饲料饲养的猪中，P. copri丰度与脂肪积累呈正相关，并且与血清中肥胖相关代谢物(如脂多糖、芳香氨基酸、支链氨基酸和花生四烯酸代谢物)的浓度呈正相关。作者还报道了P. copri在无菌小鼠中定植后由TLR4和mTOR信号介导的慢性炎症激活，这表明P. copri可以上调与脂肪生成和脂肪沉积相关基因的表达。本研究发现，小鼠灌胃P. copri可以增加肌肉量和功能，同时降低蛋白质降解基因的表达。然而，P. copri与肌肉量之间的确切机制需要更多的研究。重要的是，本研究的发现提示了通过调节肠道微生物群来治疗肌少症患者的潜力。需要进一步研究肠道微生物和支链氨基酸影响肌肉量和功能的分子机制。 

本研究也存在一些局限性。首先，我们的宏基因组和代谢组学分析是专门在中国西部进行的。因此，本研究的结果不一定适用于其他人群。其次，总体样本量较小，只有283个样本，需要更多的样本进行验证。但是本研究做了动物实验来验证我们发现的不同细菌的机制。第三，由于难以量化，我们没有调整不同民族的饮食习惯。

结论

通过宏基因组学和代谢组学分析，本研究表明，在WCHAT研究中，三个民族的肌少症患者中P. copri和BCAA水平较低。灌胃LPC可缓解小鼠肌肉质量损失和功能下降，进一步减轻肌少症。本研究证明了肠道微生物群、支链氨基酸和肌少症之间以前未知的关联，提示靶向肠道微生物群治疗肌少症的可能性。 原文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jcsm.13313 获取此篇微文原文pdf请扫描下方二维码联系微科盟多组学老师即可。